175266. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dezacetil 890 A1 és dezacetil 890 A3 előállítására
23 175266 24 rátlanítás után adjuk a C táptalaj többi komponenséhez. A lombikokat 28 °C-on 220 percenkénti fordulatszámú 5,08 cm-es löketű rázóberendezésen rázatjuk 4 napig. Az egyes lombikokból 30ml-es adagokat 15 percig centrifugálunk 8,000 percenkénti fordulatszámmal. A felülúszó adagot eltávolítjuk, csak annyit hagyunk meg, hogy a sejtek és a szilárd közeg sűrű szuszpenziót alkosson. A szuszpenzió felét ultrahangos elbontásnak tesszük ki, Branson Instrument Model LS-75 Sonifiert használunk 1,27 cm-es szondával. A bevitt energiát a H 4-es helyzetnél állítjuk be és négy egymást követő 15 másodperces besugárzási ciklust alkalmazunk, miközben a szuszpenziót jeges vízben hűtjük az elbontás alatt és között. Az N-acetil-tienamicin amidohidroláz aktivitást vagy az egész sejt-készítményben vagy a szonikátban úgy teszteljük, hogy az egész sejt vagy a szonikusan bontott szuszpenziók egy-egy alikvotját elemezzük, oly módon, hogy a szuszpenziók 5 fú-es adagjait 20 /rl 1,586 mg/ml N-acetil-tienamicin lOmM kálium-foszfát pufferrel (pH = 7) és 10 fű 0,2M kálium-foszfát pufferrel (pH = 7,4) készített oldatát tartalmazó oldatokkal inkubáljuk. Kontrollkísérleteket végzünk antibiotikumot és puffert külön tartalmazó, valamint antibiotikum nélküli sejtszuszpenziókat tartalmazó kontrollal. Ezeknek az elegyeknek éjjel 28 °C-on történő inkubálása után 2 jul-es alikvotokat különítünk el és cellulózzal bevont vékonyrétegkromatográfiás lemezekre visszük és a vékonyrétegkromatográfiás lemezeket etanol és víz 70 :30 arányú elegyével hívjuk elő. Levegővel történő szárítás után a vékonyrétegkromatográfiás lemezeket Staphylococcus aureus 6538P próbatenyészetekre helyezzük 5 percre. A vékonyrétegk matográfiás lemezeket elkülönítjük és a probate' eszeteket éjjel 37 °C-on inkubáljuk. A próbatenyészetek előállítása a következőképpen történik: Staphylococcus aureus ATCC 653SP teszt-oiganizmus éjszaka kifejlesztett növekményét fermentlé + 0,2%-os élesztőextraktumban fermentlével + 0,2% élesztőextraktummal hígítjuk és így '<:<■ nm-nél 60%-os áteresztőképességű szuszpenziói kapunk. Ezt a szuszpenziót 2,0 g/liter Difco élesztőextraktummal kiegészített Difco lápagarhoz adjuk 47-48 °C-on és így 1 liter agarban 33,2 ml s uszpenziót tartalmazó készítményt kapunk. Ennek a szuszpenziónak 40 ml-ét 22,5 cm x 22,5 cm-es Petri-csészékbe öntjük, a csészéket hűtjük és felhasználásig, azaz legieljebb 5 napig 4 'C-on tartjuk. Az inkubációs elegyben az N-acetil-tienamicin amidohidroláz aktivitását a tienamicinnak tulajdonítható bioaktív terület jelenléte jelzi Rf = 0,44-0,47-nél. A nem-reagált bioaktív N-acelu-tienamicin Rf = 0,7—0,89-nél jelentkezik. Az ebben a példában közölt eljárással izolálhatok az N-acetil-tienamicin amidohidroláz aktivitású N-acetil-etanolamin amidohidrolázt termelő mikroorganizmusok. N-acetil-tienamicin dezacetilezése lg gyeptalaj 100ml steril foszfát-puffer konyhasó oldatban történő szuszpendálásával 1 súly/térfogat%-os termékeny gyeptalaj szuszpenziót készítünk. A foszfát-puffer konyhasó oldat összetétele a következő: Foszfát puffer-konyhasó oldat nátrium-klorid 8,8 g 1M foszfát puffer pH = 7,5 10 ml desztillált víz 1000 ml. 1M foszfát puffer, pH = 7,5 előállítása 16 ml 1M kálium-dihidrogénfoszfátot 84 ml 1M kálium-hidrogénfoszfáttal keverünk össze. A foszfát puffer pH értékét kis mennyiségű 1M kálium-dihidrogénfoszfát vagy 1M dikálium-hidrogénfoszfát hozzáadásával 7,5-re állítjuk be. A fenti 1%-os talaj szuszpenziót alapul használjuk lOx, lOOx és lOOOx hígítású alikvotok előállítására. Az alapszuszpenzió 1 ml-ét vagy a lOx, lOOx és 1000x-es hígítású oldatok 1 ml-ét steril, 1% agar oldatok 2 ml-es adagjaihoz öntjük 48 °C-on. Az elegyeket gyorsan a 20 ml A táptalajt tartalmazó 85 mm átmérőjű steril Petri-csészék felületére öntjük. Az A táptalaj összetétele a következő: 2. példa kálium-dihidrogénfoszfát 3,0 g dikálium-hidrogénfoszfát 7,0 g magnézium-szulfát 0,1 g desztillált víz 1000 ml N-acetiletanol-amin oldat 8,5 ml. Az N-acetil-etanolamin oldat előállítása úgy történik, hogy az N-acetiletanolamint 10x-szeres mennyiségű vízzel hígítjuk és membrán-sterilizáljuk. Az oldatot csírátlanítás után adjuk hozzá. Szilárd táptalajnál még 20 g agart adunk hozzá. A Petri-csészéket 18 napig inkubáljuk 28 °C-on. Jól izolált telepeket választunk ki és B táptalajra visszük fel. A B táptalaj összetétele a következő: B táptalaj paradicsompép 40 g őrölt zabliszt 15 g desztillált víz 1000 ml. pH: nátrium-hidroxid hozzáadásával 6-ra állítjuk be. Szilárd közegeknél 20 g agart adunk hozzá. Egyes kiónokat kiválasztunk és 2 napig hagyjuk növekedni 28 °C-on B táptalaj ferdetenyészeteken. Ezen a ferde tenyészeteken keletkezett növekmény egy adagját a B táptalajból készített hat ferdetenyészet felületére visszük. Ezeket a ferde tenyészeteket 2 napig inkubáljuk 28°C-on. Ezt a tenyészetet Protaminobacter ruber néven azonosítjuk, majd a Merck and Co, Inc., Rahway, New Jersey cég törzsgyűjteményében MB-3528 számon 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
