175265. lajstromszámú szabadalom • Eljárás N-acetil-tienamicin előállítására
17 175265 18 A Staphylococcus aureus ATCC 6538P törzset tartalmazó tenyészeteket a következőképpen állítjuk elő: A Staphylococcus aureus ATCC 6538P tesztorganizmus egy éjjelen keresztül létrejött növekményét fermentlé + 0,2% élesztő extraktum elegyben fermentlé + 0,2% élesztőextraktum eleggyel hígítjuk oly mértékben, hogy 660 nm hullámhossznál 55%-os áteresztőképességű szuszpenziót kapjuk. A szuszpenziót 2,0 g/liter Difco-élesztő extraktummal kiegészített Difco táp-agarhoz adjuk 47—48 °C-on és így 1 liter agarban 33,2 ml szuszpenziót tartalmazó készítményt kapunk. Ennek a szuszpenziónak 5 ml-ét 85 mm átmérőjű Petri-csészékbe öntjük, a csészéket lehűtjük és felhasználásig maximum öt napig 4 °C-on tartjuk. Az elemezni kívánt antibiotikum mintákat foszfát-pufferben pH = 7 értéken megfelelő koncentrációra hígítjuk. 0,63 és 1,27 cm-es átmérőjű szűrőpapír lemezeket mártunk a teszt-oldatba és a teszt-tenyészet felületére helyezzük. A tenyészeteket 37 °Con éjszaka inkubáljuk és a gátlási zónát mm-kben mérve meghatározzuk a relatív hatékonyságot. II. Hidroxilamin-kioltási abszorpció képesség A 301 nm-nél mért abszorpció képességet - amely a szennyezett minták antibiotikum tartalmának tulajdonítható — az abszorpció képesség szelektív extinkciójával határozzuk meg híg hidroxilamiinnal történő reakciójával .. (az antibiotikum hatása egyidejűleg inaktiválódik). A mintákat 0,01 M kálium-foszfát pufferban pH = 7 értéknél állítjuk elő oly módon, hogy a kezdeti 301 nm-nél mért abszorpció (A30t) 0,1-1 között legyen. Frissen készített semleges hidroxilamint adagolunk (hidroxilamin-hidroklorid + nátrium-hidroxid, végső pH = 7), míg a minta végső koncentrációja lOnM lesz. A reakciót legalább 30 percig hagyjuk lejátszódni szobahőmérsékleten. A kapott A301 értéket a (hozzáadott reagenssel történt hígításra korrigált) kezdeti leolvasási értékből kivonva, a hidroxilamin-kioltási abszorpció képességet kapjuk. A tiszta N-acetil-tienamicin oldatok 96%-os hidroxilamin-kioltási abszorpció képességet mutatnak. 1. példa A Streptomyces cattleya NRRL 8057 törzs liofilizált tenyészetét tartalmazó kémcsövet aszeptikusán felnyitjuk és a tartalmát 0,7 ml-es steril, Davis-sóoldatot tartalmazó kémcsőbe helyezzük, a sóoldat összetétele a következő: Davis-sóoldat nátrium-citrát 0,5 g dikálium-hidrogén-foszfát 7,0 g kálium-dihidrogén-foszfát 3,0 g ammónium-szulfát 1.0 g magnézium-szulfát-heptahidrát 0,1 g desztillált víz 1000 ml Ennek a szuszpenziónak 0,2 ml-ét az A táptalaj (plusz agar) ferde tenyészetének beoltására használjuk. Az A táptalaj összetétele a következő: A táptalaj élesztő-autolízis termék (Ardaminex) 10,0 g glükóz 10,0 g foszfát-puffer 2,0 ml magnézium-szulfát-heptahidrát 0,05 g desztillált víz 1000 ml pH: nátrium-hidroxiddal 6,5-re állítjuk be. xArdamine Yeast Products Corporation Foszfát-puffer-oldat kálium-dihidrogén-foszfát 91,0 g dinátrium-hidrogén-foszfát 95,0 g desztillált víz 1000 ml Ferde tenyészetek előállításánál 25,0 g/liter agart adunk hozzá. A beoltott ferde tenyészeteket 8 napig inkubáljuk 28 °C-on, majd 4 °C-on tároljuk. A fenti ferde tenyészet spóráinak és légmicéliumainak egy adagját arra használjuk, hogy egy 50 ml A táptalajt (agar nélkül) tartalmazó 250 ml-es bedugaszolt oltási tenyészet tartására szolgáló Erlenmeyer-lombikot beoltunk vele. Ezt a beoltott tenyészetet tartalmazó lombikot 28 °C-on 220 percenkénti fordulatszámú rázógéppel rázatjuk (5,08 cm-es löket) 2 napig, ennyi idő alatt a növekedés kielégítő. 15 db 250 ml-es Erlenmeyer lombikot, melyek mindegyike 40 ml B táptalajt tartalmaz, beoltunk a beoltott növekményt tartalmazó lombik 1 ml-ével. A 6 táptalaj összetétele a következő: kukoricaliszt 20,0 g desztillációs maradék 10,0 g szójababliszt 15,0 g nátrium-citrát 4,0 g kalcium-klorid-dihidrát 0,5 g magnézium-szulfát-heptahidrát 0,1 g kobalt-klorid x 16 H20 0,01 g vas-szulfát-hcptahidrát 0,01 g ^Polyglycol 2000 0,25 térfoga t% desztillált víz 1000 ml pH: nátrium-hidroxiddal 6,5-re igazítjuk. ^Polyglycol 2000: Dow Chemical Co. A fenti 15 lombikot 28 °C-on 220 percenkénti fordulatszámú rázókészüléken rázatjuk (5,08 cm-es löket) 53 óra hosszat. 53 órás korban 15 lombik tartalmát egyesítjük. Egy aliquot részt centrifugálunk és elemzésnek vetünk alá. Az elemzés előtt a lé pH-ját nátriumhidroxiddal 5,9-ről 6,5-re állítjuk. Staphylococcus aureus ATCC 6538P és Vibrio percolans ATCC 8461 teszt-tenyészeteket használunk, 1,27 cm-es lemezeket a centrifugált fermentlé felülúszójába mártunk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
