175264. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tienamicin elkülönítésére és tisztítására
21 175264 22 A fermentációt 24 °C-on, 95 fordulat/perc sebességű keverés és 0,28m3 /perc sebességű levegőztetés közben 120 órán át folytatjuk. A rendszerhez szükség esetén további mennyiségű habzásgátlót (Polyglycol 2000) adhatunk, a habzásgátló mennyisége azonban nem haladhatja meg a rendszer össztömegére vonatkoztatott 0,1%-ot. A fermentléből időről-időre mintát veszünk, és a mintát biológiai elemzésnek vetjük alá. Az eredményeket az alábbi táblázatban közöljük. Fermentáció ideje, óra pH Gátló zóna átmérője mm 0 6,9-12 6,8-24 6,3-36 6,4 26 48 6,3 32 60 6,4 25 72 6,8 25 84 7,0 25 96 7,1 37 108 7,2 41,5 120 7,1 44,5 10 15 20 25 30 35 400 liter teljes fermentlevet szűrőprésen, 4 vegyes % szűrési segédanyag felhasználásával szűrünk, és a szűrlethez 1,2 g etiléndinitrilo-tetraecetsa'r-nát- 49 riumsót adunk. A szűrletet 6 °C-ra hűtjük, pH = 4,0±0,2 értékre savanyítjuk, és 6 °C-on tartjuk. A hideg szűrletet 41iter/perc sebességgel egy 38 liter Dowex 50 x 4 ioncserélő gyantával (nátrium-forma: szemcseméret: 20-50 mesh) töltött 45 oszlopon bocsátjuk át. A gyantaoszlopot 40 liter ionmentes vízzel mossuk, majd 2%^os, vizes piridin-oldattal eluáljuk. Az eluátumot 19 literes frakciókba gyűjtjük. Három frakciót fogunk fel, és a frakciókat biológiailag elemezzük. Az elemzési ada- 59 tok szerint a 2. és 3. frakció a fermentlé eredeti aktivitásának 27%-át tartalmazza. E frakciókat egyesítjük, 3,7 liter végtérfogatra bepároljuk, és a koncentrátumot pH = 7 értékre semlegesítjük. A koncentrátumot pH = 7,4 értékre lúgosítjuk, 55 és 200 ml/perc sebességgel egy 2,5 liter Dowex 1x2 ioncserélő gyantával (klorid-forma, szemcseméret: 50—100 mesh) töltött oszlopon bocsátjuk át. A gyantaoszlopot 200 ml/perc sebességgel ionmentes vízzel eluáljuk. A következő frakciókat 59 fogjuk fel: 2x2 liter, 1 x 800 ml, 1x4 liter, 1x2 liter. A frakciókat szükség esetén pH = 7,0 értékre semlegesítjük. A 4 liter térfogatú 4. frakciót, amelynek biológiai aktivitása a koncentrátum aktivitásának 50%-át teszi ki, 0,45 mikron pórus- 65 átmérőjű Millípore szűrőn szüljük, és az átlátszó szűrletet fagyasztva szárítjuk. 12,4 g szilárd anyagot kapunk, amelynek aktivitása 270 egység/mg. Az így kapott szilárd anyag 4 g-os részletét 50 ml 0,1 mólos 2,6-lutidin-acetát pufferoldatban (pH = 6,3) oldjuk. Az oldat pH-ját ecetsavval 6,3-ra állítjuk, majd az oldatot előzetesen a fenti pufferoldattal egyensúlyba hozott, 2,6-lutidin-formájú Dowex 50 x 8 gyantával (szemcseméret: 200-400 mesh) töltött, 5x114 cm méretű oszlopon bocsátjuk át. A gyantaoszlopot a fenti, 6,3 pH-értékű pufferoldattal, 14 ml/perc sebességgel eluáljuk. Az eluátum-áramot Mecco-matic regisztráló differenciál-refraktométerrel (gyártja az Engineering and Equipment Company, Hapboro, Pennsylvania) vizsgáljuk. 150, egyenként 20 ml térfogatú eluátumfrakciót fogunk fel, és a 72-150. frakciót 1 :50 hígításban biológiai elemzésnek vetjük alá. Az elemzés szerint a biológiaüag aktív anyagot a 76-148. frakció tartalmazza, a maximum a 92—102. frakcióban jelentkezik. A 86—113. frakciót egyesítjük, a kapott 580 ml térfogatú oldat a gyantaoszlopra felvitt anyag aktivitásának 71%-át kitevő aktivitással rendelkezik. Ezt az oldatot fagyasztva szárítjuk. A kapott szilárd anyagot 25 ml 0,1 mólos 2,6-lutidin-acetát-pufferoldatban (pH = 7,0) oldjuk, és az oldatot a fenti pufferoldattal egyensúlyba hozott, 200—400 mesh szemcseméretű Bio—Gél P-2 géllel töltött 5x108 cm méretű oszlopon bocsátjuk át. A gélt a fenti összetételű pufferoldattal 9 ml/perc sebességgel eluáljuk. Az eluátum-áramot Mecco-matic regisztráló differenciál-refraktométerrel vizsgáljuk, összesen 105, egyenként 20 ml térfogatú eluátumfrakciót fogunk fel, és a 65—80. frakciót 1 :200 hígításban biológiai elemzésnek vetjük alá. Az elemzés szerint a biológiailag aktív anyagot a 67—76. frakció tartalmazza. A 70-72. frakciót egyesítjük és fagyasztva szárítjuk. 16,0 mg, 13 800 egység/mg aktivitású szilárd anyagot kapunk. A 69., 73. és 74. frakció egyesítésével és fagyasztva szárításával 20,2 mg, 5 200 egység/mg aktivitású szilárd anyagot különítünk el. A 70—72. frakcióból elkülönített szilárd anyagot 10 ml 0,1 mólos 2,6-lutidin-acetát-pufferoldatban (pH = 7,0) oldjuk, és az oldatot a fenti pufferoldattal egyensúlyba hozott, 200—400 mesh szemcseméretű Bio-Gel P-2 géllel töltött, 5 x 108 cm méretű oszlopon bocsátjuk át. A gélt a fenti összetételű pufferoldattal 9 ml/perc sebességgel eluáljuk. Az eluátum-áramot Mecco-matic regisztráló differenciál-refraktométerrel vizsgáljuk, összesen 105, egyenként 20 ml térfogatú eluátumfrakciót fogunk fel, és a 65—80. frakciót 1 :200 hígításban biológiai elemzésnek vetjük alá. Az elemzés szerint a biológiailag aktív anyagot a 67—75. frakció tartalmazza. A 68—72. frakciót egyesítjük és fagyasztva szárítjuk. 9,1 mg, 15 000 egység/mg aktivitású szilárd anyagot kapunk. 6. példa 250 ml-es Erlenmeyer-lombikba 50 ml steril „A” táptalajt töltünk, és a táptalajban aszeptikus körülmények között liofilizált egy/Streptomyces cattleya 11
