175264. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tienamicin elkülönítésére és tisztítására
23 175264 24 NRRL 8057 tenyészetet tartalmazó, leforrasztott ampulla tartalmát szuszpendáljuk. Az „A” táptalaj összetétele: Ardamine (élesztő-autolizátum, a Yeast Products Co. gyártmánya) 10,0 g glükóz 10,0 g foszfátpuffer-oldat 2,0 ml magnéziumszulfát-heptahidrát 0,05 g desztillált víz ad 1000 ml (nátriumhidroxiddal pH = 6,5-re semlegesítve) A foszfátpuffer-oldat összetétele: kálium-dihidrogénfoszfát 91,0 g dinátrium-hidrogénfoszfát 95,0 g desztillált víz ad 1000 ml A lombikot 48 órán át 28 °C-on, rázógépen (fordulatszám: 220/perc, lökethossz: 5,08 cm) inkubáljuk, majd 40 ml tenyészetet aszeptikus körülmények között 40 ml steril, 20 térfogat%-os vizes glicerin-oldattal elegyítjük. A kapott elegy 2 ml-es mintáit steril ampullákba pipettázzuk, majd az ampullák tartalmát fagyasztjuk, és az ampullákat folyékony nitrogénnel működő fagyasztóberendezés gázfázisában tartjuk. 250 ml Erlenmeyer-lombikba 50 ml „A” táptalajt töltünk, és a táptalajt egy, a fenti módon előállított ampullás készítmény tartalmával oltjuk be. A rendszert 24 órán át 28 °C-on, rázógépen (fordulatszám: 160/perc, lökethossz: 5,08 cm) inkubáljuk. 2 literes Erlenmeyer-lombikba 500 ml „A” táptalajt töltünk, és a táptalajt 10 ml, a fentiek szerint előállított oltótenyészettel oltjuk be. A lombikot 24 órán át 28 °C-on, rázógépen (fordulatszám: 160/perc) inkubáljuk. 756 literes, rozsdamentes acél fermentorba 467 liter „A” táptalajt töltünk, és a táptalajt 100 ml, a fentiek szerint előállított oltótenyészettel oltjuk be. A rendszert 24 órán át 28 °C-on, 130 fordulat/perc sebességű keverés és 0,28 m3 /perc sebességű levegőztetés közben inkubáljuk. A rendszer pH-ja és dextróz-tartalma időben a következőképpen alakul: Inkubálás ideje, óra: 0 12 24 pH: 6,4 6,4 6,6 dextróz-tartalom, mg/ml: 8,1 8,1 8,1 5670 liter űrtartalmú, rozsdamentes acél fermentorba 4082 liter „E” táptalajt töltünk, és a táptalajt 453 liter, a fentiek szerint előállított oltótenyészettel oltjuk be. Az „E” táptalaj összetétele: keményítőcukor 25,0 g kukoricalekvár (nedves anyag, szárazanyag-tartalom: 52%) 15,0 g oldható cefre (gyártja a Brown Forman Distillers Company, Louisville, Kentucky) 10,0 g gyapotmagliszt (Pharmamedia) 5,0 g kobaltklorid hexahidrát 0,01 g kalciumkarbonát (pH-állítás után bemérve) 3,0 g Polyglycol 2000 0,25% csapvíz ad 1000 ml (nátriumhidroxiddal pH = 7,3 értékre lúgosítva) A fermentációt 24 °C-on, 70 fordulat/perc sebességű keverés és 1,52 m3 /perc sebességű levegőztetés közben, 144 órán át végezzük. A fermentléből időről-időre mintát veszünk, a mintát centrifugáljuk, és a felülúszót a korábban ismertetett módon biológiai elemzésnek vetjük alá. A kapott értékeket az alábbi táblázatban tüntetjük fel, az eredményeket *** index-számmal jelöljük. Egy további elemzési módszer szerint a minták antibiotikum-tartalmát a következőképpen vizsgáljuk: Staphylococcus aureus ATCC 6538P törzset éjszakán át 0,2% élesztőkivonatot tartalmazó táptalajon tenyésztünk, majd a tenyészetet a tenyésztéshez felhasználttal azonos összetételű közeggel addig hígítjuk, amíg a szuszpenzió fényátbocsátóképessége 660 mp. hullámhosszon vizsgálva eléri a 40%-ot/ Az így kapott szuszpenziót 2,0 g/liter Difco élesztőkivonattal kiegészített, 47—48 °C-os Difco tápagarhoz adjuk, 1 liter agárhoz 33,2 ml szuszpenziót adunk. 10—10 ml szuszpenziót 85 mm átmérőjű Petri-csészékbe töltünk, majd a Petri-csészéket felhasználásig 4 °C-on tároljuk. Az előkészített mikroorganizmust legföljebb 5 napig tárolhatjuk. A továbbiakban a korábban ismertetett módon járunk el, azzal a különbséggel, hogy az antibiotikumtartalmú mintába 1 cm átmérőjű szűrőpapír-korongot merítünk. Az eredményeket az alábbi táblázatban soroljuk fel, *2 * index-számmal jelölve. Fermentáció ideje, óra PH Gátló Dextróz zóna mg/ml átmérője* ^ mm Gátló zóna átmérője*2 * mm 0 6,6 22,2 12 6,3 20,2 24 5,8 18,0 0 36 6,0 13,2 21,5 48 6,0 8,6 21,5 60 5,7 6,4 26,5 72 5,8 2,7 25,5 84 6,2 0,3 27,5 96 6,4 0,2 36,0 108 6,4 0 35,0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
