175173. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ergot alkaloid-származékok előállítására
7 175173 8 tartalmazó T 25 közeget foglalt magában. A fermentort tárcsásturbina típusú lapátkerékkel láttunk el, amely 0,5 liter/liter/perc levegőmennyiséget biztosított 600 ford/perc sebesség mellett. Az inkubálást 23 C°-on végeztük. Négy nappal a fermentáció megkezdése után a kultúrához 4% p-klórfenilalanint adtunk. A táptalajt a fermentáció 14. napján dolgoztuk fel. Az összes pepiid -alkaloid -tartalom 600 mcg/ml volt, amelynek 65%-a 5’-debenzil-5’-p-klórbenzilergokrisztin volt. Az extrahálást az 1. példában megadott módon végeztük. 3. példa Az 1. példa szerinti törzset fermentáltuk edényekben az 1. példában megadott körülmények között, műid a vegetatív, mind pedig a termelő fázisban, az eltérés csupán az volt, hogy p-fluorfenilalanint adagoltunk a fermentáció 4. napján. A fermentáció 14. napján a táptalajt extraháltuk és így ossz '!en 750 mcg/ml peptid-aíkaloidot kaptunk, amelynek 80%-a 5 ’-debenzil-5 ’-p-fluorbenzilergokrisztin. Olvadáspont: 160-165C0 (bomlik); [a]20=—171° (kloroformban) D 4. példa A TCC 15383 törzs, amely ergotamint termel, ferde tenyészetből származó micéliumszövevényét steril vízben szuszpendáltuk, nagyon rövid részecskékké törtük Warint keverőben keverve, majd selyemszöveten átszűrtük. A szűrletből 5 ml-t UV lámpa fényének tettünk ki, (520 p watt/cm2) 50 másodpercig. A szuszpenziót Petri-csészékben szilárd közegre vittük, ahol 1% íenilalanint adtunk hozzá. 12 napig 28 C°-on való inkubálás után a megnövekedett kolóniákat ismétlő-térítő módszerrel TM szilárd közegre vittünk Petri-csészékben és a lapokat 28 C°-on 12 napig inkubáltuk. A 2000 vizsgált kolónia közül 2 fenilalanintól függő mutánst találtunk. E törzsek egyikét inokulumként használtuk edényben történő fermentációhoz az 1. példában megadott körülmények között, mind a vegetatív, mind pedig a termelő fázisban. A termelő fázis 4. napján 4% p-klórfenilalanint adagoltunk a táptalajhoz. A táptalaj a 14. napon összesen 900 mcg/ml peptidalkaloidot eredményezett, amelynek 80%-a 5’-debenzil-5’-p-fluor- 5 benzilergotamin volt. Olvadáspont: 180-186 C° (bomlik); [o0d° = -150 (kloroformban) 5 .példa 10 A TCC 20019 törzs, amely ergokriptint termel, ferde tenyészetből származó micéliumszövevényét steril vízben szuszpendáltuk, Waring keverőben keverve aprítottuk, majd selyemszöveten átszűrtük. A szűr- 15 létből 5 ml-t UV sugárzásnak tettünk ki (520 p watt/ cm2) 45 másodpercig. A szuszpenziót szilárd közegre vittük Petri-csészékben és 1 % 1-leucint adtunk hozzá. 12 napig 28 C°-on végzett inkubálás után a megnövesztett kolóniákat ismétlő-térítő módszenei TM 20 szilárd közegre vittünk Petri csészékben és a lapokat 28 C°-on 12 napig inkubáltuk. A 4000 vizsgált kolónia közül 3 bizonyult leucintól függő mutánsnak. E törzsek egyikét az 1. példában leírt körülmények között ugyanolyan közegben fermentáltuk azzal az 25 eltéréssel, hogy a vegetatív és a termelő fázisban 1 g/1, illetve 2 g/1 L-leucint adtunk. A termelő fázis 4. napján 6 g/1 L-norvalint adtunk a táptalajhoz. A 14. napon a táptalaj összesen 1.000 mcg/ml peptid-alkaloidot tartalmazott, amelynek 80%-a 5’-deizobutil-5’' 30 -n-propüergokriptin volt. Olvadáspont: 190-195 C°; [a]= -183°(kloroform) 6. példa 35 Az 5. példában alkalmazott leucintól függő törzset használtunk és edényekben fermentáltunk a vegetatív fázisban és a termelő fázisban ugyanolyan körülmények között. A táptalajhoz 3 g/1 5,5,5-trifluor- 40 leucint adtunk a termelő fázis 4. napján. A fermentáció 14. napján a táptalajokat egyesítettük, az előzőekben leírt módszer szerint extralháltuk és így összesen 600 mcg/ml peptid-alkaloidot kaptunk, amelynek 60%-a trifluor-leucin volt. II. Táblázat Közegek pép 3 TM TG T 25 Glükóz — — 100 — Szacharóz g 300 100 300 L-aszparagin.Hj O-10 vízmentes citromsav — — 10 15 káliumdihidrogénfoszfát 0,5 0,5 0,5 0,5 magnéziumszulfát 7H20 0,5 0,3 0,3 0,5 élesztőkivonat-0,1 0,1 4
