175173. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ergot alkaloid-származékok előállítására
5 175173 6 A táptalajt szűrjük és a micéliumot 4%-os vizes borkősav-oldattal néhányszor extraháljuk. Szűrés után a vizes fázist nátriumhidroxid-oldattal 9 pH-ig lúgosítjuk és utána metilénkloriddal extraháljuk. A szerves fázist betöményítjük, kicsapjuk a terméket és foszforsóként kristályosítjuk. A foszfátból a szabad bázist kicsapjuk és utána a természetes alkaloid-analógokkal szilikagél-oszlopon dúsítjuk. Az új termékeknek a természetes anyagoktól való elválasztását frakdonált kristályosítással végezzük. Az alkaloid- koncentrációt spektrofotometriásán határozzuk meg Van Urk reagenssel való festés után és \=550 mpnél leolvassuk. A természetes és a helyettesített aminosavak közötti arányokat — amelyek a peptid-részben vannak jelen - az alkaloid savas hidrolízisével és az egyes aminosavak kvantitatív meghatározásával állapítjuk meg. A végtermékek azonosítására a szokásos műszeres analíziseket (NMR, IR, MS, UV és hasonlók) alkalmazzuk. Ergocisztint vagy ergotamint termelő törzsek fenilalanint igénylő mutánsai olyan alkaloid-analógok termelésére képesek, amelyek a fenilalanin-részben olyan fenilalanint tudnak beépíteni, amely a benzolgyűrűben halogénatomokkal, alkil- vagy alkoxi-csoportokkal van helyettesítve. Ezek olyan alkaloidok termelésére is képesek, amelyeknél a fenilalanin részbe ennek izoészterei, így tienilalanin, a- és ß-pirazolilalanin, furilalanin vagy piridilalanin van beépítve. Ergokriptint termelő törzsek leucint igénylő mutánsai olyan alkaloid-analógok termelésére képesek, amelyek a leucdn-részbe egy 2-7 szénatomos egyenesláncú a-aminosav-molekulát képesek beépíteni. Ezek olyan alkaloidok termelésére is képesek, amelyeknél a leucin-részben halogénatomokkal helyettesített természetes aminosavak, így 5,5,5-trifluorleucin, vannak beépítve. A találmány szerinti eljárást a következőkben kiviteli példákon is bemutatjuk. 1. példa 5 • -debenzil-5’-p-klórbenzilergokrisztin Claviceps purpurea ATCC 20103, amely ergocisztint termel alámerített kultúrában, „pép 3” szilárd közegen ( II. táblázat) 12 napos ferde tenyészetből származó micéliumszövevényét 50 ml steril desztillált vízbe vittük és egy Waring keverőben 20 másodpercig kevertük. A szuszpenziót selyemszöveten átszűrtük és 5 ml szűrletet UV-lámpa fényének tettük ki 45 másodpercig 6520 p watt/cm2). A kezelt szuszpenziót megfelelő hígítás után Petri-csészékben TM szilárd közegre (II. táblázat) vittüt és 1% fenilalanint adtunk hozzá. A kapott lapokat 20 C°on 10-12 napig inkubáltuk. A megnövekedett kolóniákat a jól ismert ismétlő-térítő módszerrel (Lederberg, J. Bacy. 63, 399, 1952) TM szilárd közegre vittük Petri-csészékben és a lapokat 28 C°-on 10-12 napig inkubáltuk. A 3000 kolóniából 4 törzset találtunk alkalmatlannak minimális TM közegen való növekedésre. Ezeket a törzseket TM közegen, valamint fenilalaninnal adagolt TM közegen igazoltuk, amelyek közül 2 törzs szigorúan fenilalanintól függő mutánsnak bizonyult. Tíz darab 300 ml-es edény mindegyikébe 50 ml TG közeget (II. táblázat) tettünk és 1 g/1 fenilalanint adtunk hozzájuk, majd 100 C°-on 30 percig inkubáltuk azokat. Ezt követően ezeket egyenként beoltottuk a mutáns törzs „pép 3” szilárd, közeg ferde tenyészetéből származó körülbelül '1 cm2-nyi micéliumszövevényével, majd az edényeket 225 ford/perc sebességű és 5 cm átmérőjű kört leíró forgó keverőben 23 C°-on inkubáltuk 4 napig. Ezeket az edényeket vegetatív fázisnak nevezzük. ötven darab 300 ml-es edény mindegyikébe 40 ml T 25 közeget (II. táblázat) tettünk, majd mindegyikhez hozzáadtunk I g/1 1-fenilalanint és ezeket 105 C°-os 25 percig sterilizáltuk. Ezt követően ezeket beoltottuk 5 ml vegetatív-kultúrával és 23 C°-on inkubáltuk a vegetatív fázishoz használt keverőben. Az edényhez 4 nap múlva hozzáadtunk 4 g/1 p-klórfenilalanint. További 10 napos inkubáció után a kultúrákat összegyűjtöttük és így körülbelül 2 liter táptalajt kaptunk, amely összesen 700 mcg/ml pepiid-alkaloid hozamnak felel meg. Ezeket a következő módon extraháltuk; 5’-debenzil-5’-p-klórbenzil-ergokrisztin extrahálása A táptalaj-kultúrát szűrtük, a szűrletet elöntöttük és a micéliumot 5 %-os vizes borkősav-oldatban szuszpendáhuk. Erőteljes rázás és szűrés után a csapadékot kétszer extraháltuk. A szűrleteket egyesítettük, 20%-os vizes nátriumhidroxid-oldattal 9 pH-ig lúgosítottuk és metilénkloriddal néhányszor extraháltuk. A szerves fázist vízzel mostuk, betöményítettük és a bázist hexánnal kicsaptuk. Az így kapott 0,9 g nyers bázist aktívszénnel szintelenítettük, 10 ml 95 %-os etanolban oldottuk és az oldathoz hozzáadtunk 0,8 ml 75 %-os foszforsavat. Ez oldatot sötétben 30 percig melegítettük visszafolyatás közben és végül 3 C°-on 5 napig állni hagytuk. Ilymódon 0,5 g foszfát krisztályosodott ki, amely ergokrisztin (20%) és 5’-debenzil-5’-p-klórbenzilergokrisztin (80%) elegye. A foszfátból a nyers bázist úgy kaptuk, hogy a foszfátot meglúgosítottuk, a bázist metilénkloriddal extraháltunk és acetonból ismét átkristályosítottuk. A kristályos terméket szilikagél-oszlopon kromatografáltuk, az eluálást kloroform-metanol-eleggyel végeztük (kezdeti arány: 99:1, végső arány: 90:10). A jobbraforgató izomereket tartalmazó frakciókat elöntöttük és az 5 ’-debenzil-5 >' -p-klórbenzil-ergokrisztint kinyertük. Benzolból, metanolból, acetonból való sorozatos átkristáyosítás után a terméket (100 mg) leszívatással elkülönítettük. Az MS analízisnél jellemz töredékeket mutatott és mle: 376 és 378; 278 és 280; 267, 153, 70. A peptid-rész savas hidrolízise a prolin és a p-klór-fenilalanin aminosavakat 1:1 arányban szogáltatta. A lúgos hidrolízise lizergsavat és dimetilperuvinsavat adott. Olvadáspont: 150-155 C° (bomlik); [a]f,0 = -175° (kloroformban) 2. példa Az 1. példa szerinti törzset használva UV fényes kezeléssel kapott mutáns törzset 8 darab TG közeget tartalmazó edénybe oltottuk be az 1. példában megadott körülmények között. A vegetatív fázis végén ezeket az edényeket egyesítettük és így 400 ml táptalaj-kultúrát kaptunk, amelyet 10 literes fermentorba oltottunk be, amely 6 liter 1% fenilalanint • 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
