175049. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új BU-2231 jelű glikopeptid-antibiotikum-komplex, az egyes komponensek és származékok előállítására
9 175049 10 mány szerinti eljárás elvégezhető az említett mikroorganizmus mutánsaival is, amely mikroorganizmusokat a szakemberek előtt ismert módon, például az új mikroorganizmusnak röntgen vagy ultraibolya sugárzással, nitrogénmustárral, fágokkal vagy hasonlókkal végzett kezelése útján nyerhetünk. Az antibiotikumok előállítása A találmány szerint a Bu-2231 jelzésű antibiotikum előállítására úgy járunk el, hogy a Bu 2231 jelzésű antibiotikumot termelő Streptoalloteichus hindustanus E465--94, A.T.C.C. 31158 törzzsel süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között valamely vizes táptalajon addig tenyésztjük. amíg megfelelő mennyiségű antibiotikum halmozódik fel a táptalajban. Felhasználható szénforrást. például valamely felhasználható szénhidrátot tartalmazó táptalajon tenyésztjük a mikroorganizmust. Ilyen alkalmas szénforrások a glükóz, ribóz. galaktóz. fruktóz. mannóz, szacharóz, laktóz. oldható keményítő és a glicerin. A táptalajnak felhasználható nitrogénforrásokat is kell tartalmaznia, például hallisztet, szójalisztet. kukoricalekvárt, peptonokat, húskivonatot, földimogyorólisztet, élesztőkivonatot vagy ammónium-sókat. Szükség esetén szervetlen sókat, például nátrium-kloridot, kálium-kloridot, magnézium-szulfátot, kalcium-karbonátot, foszfátokat stb. is adunk a táptalajhoz. Ha ez kívánatos, nyomelemeket, mint például rezet, mangánt, vasat, cinket stb. adunk a közegbe, vagy bevihetjük őket egyszerűen mint a táptalaj egyéb alkotóelemeinek szennyezéseit is. Tenyészthetjük a Bu-2231 jelzésű antibiotikumot termelő törzset bármely olyan hőmérsékleten, amelyen az növekszik, például 20 °C és 54 °C között, de előnyösen 25 °C és 35 °C között, különösen 27 'C és 32 °C között végezzük a fermentációt. Semleges vagy közel semleges pH-értéknél, például pH =- 6—7-nél kezdjük a fermentálást, és általában 2 -7- napon át folytatjuk az antibiotikum termelését. Rendszerint 3-5 nap alatt érhetjük el az optimális termelést. Viszonylag kis mennyiségű antibiotikum előállítására használhatunk rázott lombikokat, vagy felületi tenyészeteket, nagyobb mennyiség előállítására azonban előnyösebb, ha steril tartályokban, süllyesztett, levegőztetett körülmények kozott végezzük a fermentálást. A tankfermentáiáshoz először vegetatív inokulumot kell készítenünk oly módon, hogy a mikroorganizmus spórájával beoltjuk a táptalajt, és akkor visszük át a tartályban levő közegbe steril körülmények között, amikor már egy fiatal, aktív vegetatív inokul um kifejlődött. Mind a tartályokat, mind a lombikokat úgy levegőztethetjük, hogy steril levegőt vezetünk a fermentáció közegébe, vagy annak felszínére. További keverést mechanikai keveréssel biztosíthatunk. Szükség esetén habzásgátló anyagot, .például disznózsírt alkalmazhatunk. A fermentáció során egyszerűen követhetjük a Bu-2231 termelését a papírkorong-agardiffúziós módszerrel, teszt mikroorganizmusként Bacillus subtilis PCI—219-et és Mycobacterium 607, M6-3 törzset használva. Mind a Bu-2231 A, mind a Bu-2231 B, mind pedig az ezekkel együtt termelt, feltehetően nebramicin faktorok aktívak a B. subtilis PCI-219-cel szemben, a M. 607 M6-3-mal szemben azonban csak a Bu-2231 A és a Bu-2231 B. Rázottlombik tenyészetben az E465-94 jelzésű törzs 3-5 nap alatt 50-100 mikrogramm/ml Bu-2231 komplexet termel. A Bu—2231 komplex izolálása és tisztítása Miután az antibiotikum koncentrációja a táptalajban elérte az optimumot (például a fent említett módszerrel meghatározva), hagyományos módszerekkel, mint például szűréssel vagy centrifugálással elkülönítjük a micéliumot, és az oldatlan alkotóelemeket a fermentléből. Az antibiotikus aktivitás a fermentlében van, ahonnan hagyományos adszorpciós módszerekkel nyerhető ki. Az ezen kinyerés céljaira legelőnyösebben alkalmazható adszorbensek a kationcserélő gyanták, például a Rohm and Haas Company-tól az „Amberlite 1RC—50" kereskedelmi néven beszerezhető IRC-50 típusú gyanták. A szükség esetén pH = 7-re semlegesített szűrletet valamely kationcserélő gyantával, például ammónium-fázisú Amberlite IRC-50-nel töltött oszlopon csurgatjuk át. Utána vízzel kimossuk a gyantát. Az E465—94 jelzésű mikroorganizmus a Bu -2231 antibiotikum-komplexen kívül egy nebramicin faktorokból álló aminoglikozid antibiotikum-komplexet is termel. A találmány szerinti Bu-2231 komplexet úgy választhatjuk el ettől az aminoglikozid szennyezéstől, hogy valamely híg bázis-oldattal, például 0,25 normál ammónium-hidroxid-oldattai mossuk az oszlopot. Ekkor a Bu—2231 komplex a gyantán abszorbeálva marad, és a későbbiekben valamely ásványi sav oldatával, például 2-es pH-jú sósavoldattal eluálhatjuk, a Bu—2231-et tartalmazó frakciókat összegyűjthetjük, és egyesíthetjük. Részleges tisztítást végezhetünk oly módon, hogy valamely alkalmas adszorbensen. mint például aktívszénen kromatografáljuk az egyesített Bu-2231 frakciókat, és például savas pH-értéknél vizes butanoilal eluáljuk a komplexet, leválasztjuk a butanolos réteget, majd fagyasztva szárítjuk, vagy csökkentett nyomáson betöményítjük a vizes réteget, ily módon nyeljük a szilárd Bu 2231 komplexet. E komplex további kromatografálása és/vagy gélszűrése útján nyerhetjük a megtiszított, réztartalmú szilárd komplexet. A Bu—2231 A és B komponens szétválasztása A Bu-2231 komplexből úgy választhatjuk szét a Bu-2231 A és B glikopeptid komponenst, hogy valamely módosított dextrán-alapú kationcserélőn, például valamely, a kereskedelemben a CM-Sephadex C—25 néven beszerezhető módosított poliszacharid-dextránon gradiens elúciós kromatográfiát végzünk. Az — előnyösen a fent leírt módon megtisztított — Bu—2231 komplex vizes oldatát egy, a módosított dextrán-alapú ioncserélővel töltött oszlopra öntjük fel. A bleomicinekhez [J. Antibiotics 19, 210-215 (1966)] hasonlóan, ezen eljárással könnyebb a komponenseket azok rézzel megfelelő mértékben kelátformává alakított formájában szét5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
