175045. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és berendezés sejttenyészet előállítására
9 175045 10 hatunk. Az ilyen tulajdonsággal rendelkező, kettős spirál formájában jelenlevő ribonukleinsavak bizonyos gombákat (Penicillia vagy Aspergilli) megfertőző vírusokból különíthetők el [1 170 929 számú nagy-britanniai szabadalmi leírás, Banks és munkatársai, Nature, 218, 542 (1968), és 1 300 259 számú nagy-britanniai szabadalmi leírás]. A találmány szerinti eljárás értelmében különösen előnyösen alkalmazott interferonindukáló anyag a vírusos eredetű kettős spirális ribonukleinsav, amely megtalálható a különböző Pénicillium és Aspergillus fajtákat megfertőző vírusrészecskékben. Ilyen például a Pénicillium chrysogenum [1 170 929 számú nagy-britanniai szabadalmi leírás], a Pénicillium stoloniferum [Nature, 218, 542 (1968)], a Pénicillium cyaneofulvum [Nature, 213, 155 (1968)], az Aspergillus niger és az Aspergillus foetidus (1 300 259 számú nagy-britanniai szabadalmi leírás). Célszerűen a Pénicillium chrysogenum megfertőzésére alkalmas vírusrészecskékben található ribonukleinsavat alkalmazzuk. A sejtek vírussal történő megfertőzése esetén, az alkalmazott sejt típusa függ az előállítandó vakcina típusától. Gyógyszer vakcinákban felhasználásra kerülő vírus antigéneket magasabb főemlősöktől, például a majomtól vagy az embertől származó sejtekből állítunk elő, célszerűen azonban emberi sejteket alkalmazunk. Állatgyógyászati vakcinákban felhasználásra kerülő vírus antigéneket megfelelő állati sejtekből nyerünk. A sejteket olyan módon fertőzzük meg, hogy a fertőző vírussal tenyésztjük őket. Például az alábbi vírusok állíthatók elő a találmány szerinti eljárással vakcinák készítése céljából: veszettség, kanyaró, mumpsz, gyermekbénulás, adenovirus, sárgaláz, parainfluenza, herpesz, citomegalovírus, influenza, hepatitisz és légzőszervi szinkitial vírus. Állatgyógyászati célokra például a következő vírusok állíthatók elő: Marek-kór, parainfluenza, adenovirus, szopornica, macska-leukémia, fertőző marhaorr- és légcsőgyulladás, fertőző bronchitis, száj- és körömfájás, borjú hasmenés, pszeudoveszettség, fertőző gége-légcsőhurut, átörökíthető gyomor- és bélhurut. Az interferonindukáló anyaggal vagy a fertőző vírussal történő kezelés előtt a sejteket felvisszük a hordozónak legalább is egy részére, és kívánt esetben összefüggő lemez képződéséig tenyésztjük a találmány szerinti eljárással. Erre a célra bármelyik korábban ismertetett táptalaj alkalmas. Fibroblasztok alkalmazása esetén Eagle-féle táptalajt alkalmazunk, amelyhez adalékanyagként magzati marhaszérumot, marhavelő-kivonatot, nem-esszenciális aminosavakat, Earle-sókat, aszkorbinsavat és antibiotikumot adunk, a nátriumhidrogénkarbonáttal pufferoljuk. Az interferon előállításánál az interferont a sejtlemezekben indukáljuk, vagy a hordozónak az interferonindukáló anyagot tartalmazó közeggel való elárasztásával, vagy pedig a közeget vékony filmként visszük rá a hordozó felületére, ahol a fűmet az interferonindukáló anyagot és felületaktív anyagot tartalmazó közegből készített habból nyeljük. Célszerűen az interferonindukálást a sejtnövekedés számára is megfelelő hőmérsékleten, azaz 35—38 cC közötti, előnyösen 37 °C hőmérsékleten végezzük. Az indukálás 1—3 órán át tarthat. Azt tapasztaltuk, hogy előnyös, ha 2 órán keresztül indukálunk. Áz alkalmazott közeg olyan oldat, amely a kettős spirális ribonukleinsavat tartalmazza, bármelyik ismert folyékony táptalajban, amelyhez kívánt esetben felületaktív anyagot is adunk. Célszerűen úgy járunk el, hogy a ribonukleinsavat a sejttenyészet készítéséhez alkalmazott táptalajjal megegyező közegben oldjuk fel. Fibroblaszt sejtek használata esetén, előnyösen a ribonukleinsavat minimális mennyiségű Eagle-féle táptalajban oldjuk fel, amelyhez antibiotikumot és DEAE dextránt is adunk, és nátriumhidrogénkarbonáttal fiziológiás pH-értékre állítjuk be. Vírus előállításánál a sejteket olyan módon fertőzzük, hogy vagy elárasztjuk a hordozót a fertőző közeggel, vagy ez utóbbit vékony film formájában visszük fel a hordozó felületére. A filmet a felületaktív anyaggal kiegészített fertőző közegből előállított habból nyerjük. A fertőző közeg olyan oldat, amely a vírust bármelyik ismert táptalajban tartalmazza, és kívánt esetben adalékként felületaktív anyagot is adunk hozzá. Általában különösen előnyös, ha a vírust ugyanabban a közegben szuszpendáljuk, amelyet a sejttenyészet előállításához táptalajként alkalmazunk. Fibroblaszt sejtek használata esetén az előnyösen alkalmazott közeg minimális esszenciális Eagle-féle közeg, amelyben a vírust szuszpendáljuk, adalékként pedig antibiotikumot és DEÁE dextránt adunk hozzá, és nátriumhidrogénkarbonáttal fiziológiás pH-értékre állítjuk be. Á fertőzést előnyösen a sejtnövekedés számára is megfelelő hőmérsékleten végezzük, azaz 35- —38 °C között, célszerűen 37 °C-on. Időtartama 1 —3 óra lehet, célszerűen 2 óra. Az indukálás vagy a fertőzés befejeztével a sejtekből foszfát puffert tartalmazó fiziológiás sóoldattal kimossuk az indukáló vagy fertőző közeget, vagy bemerítéses módszerrel, vagy pedig a sóoldatot vékony filmként vezetjük a sejtekhez. Ezután gyűjtőközeget vezetünk a sejtlemezekhez vékony film formájában, 6—25, célszerűen 16- —20 órán át interferon összegyűjtése esetén, és 3—7 napig vírus összegyűjtésekor. A gyűjtőközeg bármilyen ismert folyékony táptalaj lehet. Különösen előnyös, ha ugyanolyan közeget alkalmazunk, mint a sejttenyészet előállításához. Fibroblaszt sejtek esetén különösen előnyös gyűjtőközeg a minimális esszenciális Eagle-féle táptalaj, amelyhez adalékként magzati marhaszérumot és antibiotikumot adunk, s nátriumhidrogénkarbonáttal fiziológiás pH-értékűre állítjuk be. A termelt anyag összegyűjtése a sejttenyészet előállításához általában alkalmazott hőmérsékleten történik, azaz 35—38 °C között, célszerűen 37 °C-on. Az interferon vagy a vírus összegyűjtésének befejeztével a gyűjtőközeg áramoltatását leállítjuk, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
