175006. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peroxidázt tartalmazó készítmények stabilizálására
175006 4 liofilizálás során, illetve annak következtében csökkenhet a peroxidáz aktivitása. A peroxidázt ezért nem szívesen használják. Meglepő módon azt találtuk, hogy a peroxidázt tartalmazó liofilizált vagy nem liofílizált készítmények stabilitását lényegesen fokozhatjuk, ha többértékű fémionokat adunk a készítményekhez. Minden többértékű fémiont használhatunk e célra, de különösen a periódusos rendszer 3. és 4. periódusához tartozó ionokat találtuk megfelelőnek, nevezetesen a Mg-, Ca-, So-, Ti-, V-, Cr-, Mn-, Fe-, Co-, Ni-, Cu-, Zn-, Ga- és Al-ionokat. Előnyösnek bizonyult ezek közül az Al-, Zn-, Mg- és Cu-ion, legelőnyösebbnek pedig a Fe-ion,. különösen a ferro-ion. Ez utóbbiak ugyanis általában erősebb stabilizáló hatást mutatnak, mint a többiek. A fémionokat általában egy megfelelő fémsó, így például szulfát, foszfát, halogenid vagy nitrát alakjában adjuk a kompozícióhoz. A stabilizáló hatás kifejtéséhez legalább 0,0001 M fémvegyület szükséges. A fémvegyület mennyiségének felső határa nem kritikus, azonban általában 0,05 M elegendő az optimális stabilitás eléréséhez, az ennél nagyobb mennyiségben tehát fölösleges és túlzott. Az említett mennyiségű fémvegyületet milliliterenként 1 nanogramm és 25 mikrogramm közötti mennyiségű peroxidázt tartalmazó vizes oldathoz adjuk, melyben azonban általában milliliterenként 10 nanogramm és 10 mikrogramm közötti mennyiségű peroxidáz van. Az immunológiai vizsgálatnak a fémionok zavaró hatásától való megóvása végett a készítményhez célszerűen egy kelátképző anyagot adunk. Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy a kelátképző anyag nem korlátozza a fémionok stabilizáló képességét. Megfelelő kelátképző anyag például az etiléndiamin-tetraacetát (EDTA), a citromsav, a borkősav, a glucuronsav, a cukorsav és e savak megfelelő sói. A fenti komponenseken kívül más komponenseket is adhatunk a kompozícióhoz, így puffereket, cukrokat, például szacharózt, szorbitot vagy mannitot, egy polietilénglikolt és/vagy proteineket, például albumint. A stabilizáláshoz szükséges mennyiségű fémiont és adott esetben egyéb komponenseket tartalmazó vizes peroxidázos készítményt minden további feldolgozás nélkül forgalomba hozhatjuk, általában azonban előbb liofilizáljuk. A vizet és peroxidázt tartalmazó készítmény fagyasztva szárítását a szokásos módon végezzük. Az anyagot -40 és -50 °C közötti hőmérsékleten fagyasztjuk, és a jeget csökkentett nyomáson szublimáljuk. A szublimáció előtt azonban granulákat is készíthetünk a vizes kompozíció levegőbe való porlasztásával vagy úgy, hogy a vizes kompozíció cseppecskéit egy olyan vízzel nem elegyedő folyadékba szórjuk, amely teljes egésze vagy egy része alacsonyabb hőmérsékletű, mint a vizes kompozíció fagyáspontja. Ez utóbbi módszer előnye, hogy olyan fagyasztva szárított granulák előállítását teszi lehetővé, amelyek előre meghatározott és pontosan kimért mennyiségű reagenst tartalmaznak. A következő táblázatban bemutatjuk néhány fémion stabilizáló hatását. A táblázatban megadott számok azt az időt mutatják hetekben, amelynek elmúl3 tával még legalább 80%-a fennmarad az eredeti enzim-aktivitásnak. Fémvegyület Koncentráció Hőmérséklet (°C) 4 25 37 Kontroll _ 8 2 1 Alumínium(III)-szulfát 0,01 16 16 10 Magnézium-szulfát 0,01 16 ' 2 1 Cink(II)-klorid 0,01 16 2 1 Vas(III)-szulfát 0,01 20 20 20 A találmányt az alábbi példákkal világítjuk meg közelebbről az oltalmi kör korlátozása nélkül. 1. példa Egy torma-peroxidázt (HRP—RZ 0,6) és albumint (BSA) 1:10 arányban tartalmazó készítményt az alábbi pufferekben oldunk: a) 0,02 mólos foszfátpuffer, pH 6,0 0,1% laktalbumin, 2,5% mannit és 10"“ M ferroszulfát. b) Ugyanaz, mint a), de ferroszulfát nélkül. Mindkét oldatba 12 ng/ml torma-peroxidázt viszünk be. Az oldatokat fagyasztva szárítjuk 0,5 ml oldatot tartalmazó ampullákban. A két termék peroxidáz-aktivitását közvetlenül a fagyasztva szárítás után meghatároztuk. A kapott pelleteket 2 ml frissen készített szubsztrát oldatban (25 jul 30%-os hidrogénperoxid és 40 mg o-feniléndiamin 200 ml 0,1 M nátriumfoszfát pufferban, pH=6,0) újra szuszpendáltuk és 60 percig inkubáltuk. Az enzimes reakciót 0,2 ml 4 n kénsav hozzáadásával állítottuk le. Ezután az anyagot 5 percig centrifugáltuk 2000 g értéken, és optikai sűrűségét 492 nm-nél mértük egy Gilford 300—N típusú spektrofotométeren. Analóg eljárással elkészítettünk egy az eredeti oldatnak megfelelő enzimaktivitású készítményt is. 0,5 ml torma-peroxidáz oldatot összekevertünk 1,5 ml frissen készített szubsztrát oldattal (25 pl 30%-os hidrogénperoxid és 40 mg o-feniléndiamin 150 ml 0,1 M nátriumfoszfát pufferban, pH=6,0). Az a) oldattal készített kompozíció változatlan enzim-aktivitást mutatott, míg a b) oldattal készített kompozíció enzimaktivitása csupán 38%-a volt az eredeti enzim-aktivi tásnak. 2. példa Torma-peroxidázból (RZ 0,6 azaz 0,6 „Reinheitszahl”-tisztasági értékkel jelzett) 8 pg/ml koncentráció jú oldatot készítünk az alábbi pufferekkel: a) 0,01 mólos 4-(2-hidroxietil)-piperazin-eténszulfonsav (a továbbiakban HEPES) pH 8,0, 2% szacharóz, 6% mannit és 0,01 M ferroszulfát. b) Ugyanaz, mint az a), de ferroszulfát nélkül. Mindkét oldatból mintegy 50 pl-es cseppecskéket gyűjtünk össze folyékony nitrogénben, azután fagyasztva szárítjuk és szobahőmérsékleten tároljuk. A peroxidáz-aktivitást oly módon határoztuk me& hogy a fagyasztva szárított pelleteket 10 ml nátrium foszfát pufferban feloldottuk. 0,5 ml így kapott olda-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
