175006. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peroxidázt tartalmazó készítmények stabilizálására
5 175006 6 tot összekevertünk 1,5 ml frissen készített szubsztrát oldattal (25 p\ 30%-os hidrogénperoxid és 40 mg o-feniléndiamin 150 ml 0,1 M nátriumfoszfát pufferban, pH=6,0), és a keveréket 60 percig inkubáltuk. Az enzimes reakció leállítására 0,2 ml 4 n kénsavat adtunk a keverékhez. Ezután az anyagot 5 percig centrifugátok 2000 g értéken, majd optikai sűrűségét egy Gilford 300-N típusú spektrofotométeren 492 nm-ná leolvastuk. 52 hét múlva az a) oldattal készített kompozíció eredeti peroxidáz-aktivitásának 80%-ával rendelkezett, míg a b) oldattal készített kompozíció aktivitása az eredeti aktivitás 17%-ára csökkent. 3. példa ösztradiol és citokróm C peroxidáz kapcsolási termékéből oldatot készítünk az alábbi pufferekkel: a) 0,36 mólos HEPES, 2% szacharóz, 6% mannit, 0,01 M EDTA és 0,01 M ferroszulfát (pH 7,4). b) Ugyanaz, mint az a), de ferroszulfát nélkül. Az oldatokat fagyasztva szárítjuk és 37 °C hőmérsékleten tároljuk. A peroxidáz-tartalom 270 ng/ml. 18 hét múlva az a) oldattal készített termék aktivitása — melyet a 2. példa szerinti módon határoztunk meg — gyakorlatilag változatlan volt, és a készítmény ugyanúgy viselkedett az enzimes immunitásvizsgálatban, mint az eredeti konjugát. A b) oldattal készített kompozíció aktivitása ezzel szemben az eredetinek 50%-ára csökkent. 4. példa ösztriol és torma-peroxidáz kapcsolási termékét az alábbi közegekben oldjuk: a) 0,01 mólos HEPES, 0,01 M EDTA, 2% szacharóz és 0,01 M alumíniumszulfát. b) Ugyanaz, mint az a), de alumíniumszulfát nélkül. Mindkét oldatot fagyasztva szárítjuk cseppecskékre bontva, amint a 2. példában leírtuk. Ezután a készítményeket 37 °C-on tároljuk. 11 hét múlva az a) oldattal készített kompozíció aktivitása - melyet a 2. példa szerinti módon határoztunk meg — változatlan volt, míg a b) oldattal készített kompozíció enzimaktivitása néhány nap múlva teljesen megszűnt. 5. példa Humán placentális laktogén (HPL) és torma-peroxidáz (HRP-RZ 0,6) kapcsolási termékét az alábbi pufferokban oldottuk: a) 0,36 M HEPES, 2% szacharóz, 6% mannit, 0,01 M EDTA és 0,01 M ferroszulfát (pH=7,4). b) Ugyanaz, mint az a), de ferroszulfát nélkül. Anti-hepatitis B antitestek és torma-peroxidáz kapcsolási termékét az alábbi pufferokban oldottuk: c) 0,36 M HEPES, 2% szacharóz, 6% mannit, 0,01 M EDTA és 0,01 M magnéziumszulfát. d) Ugyanaz, mint a c), de magnéziumszulfát nélkül. e) 0,36 M HEPES, 2% szacharóz, 6% mannit, 0,01 M EDTA és 0,01 M alumíniumszulfát. f) Ugyanaz, mint az e), de alumíniumszulfát nélkül. g) 0,36 M HEPES, 2% szacharóz, 6% mannit, 0,01 M EDTA és 0,01 M alumíniumfoszfát. h) Ugyanaz, mint a g), de alumíniumfoszfát nélkül. Humán immunoglobiüinnal szembeni juh-antitestek és citokróm C peroxidáz kapcsolási termékét az alábbi pufferokban oldottuk: i) 0,36 M HEPES, 2% szacharóz, 6% mann't, 0,01 M EDTA és 0,01 M cinkkiorid. j) Ugyanaz, mint az i), de cinkklorid nélkül. k) 0,36 M HEPES, 2% szacharóz, 6% mannit, 0,01 M EDTA és 0,01 M cinknitrát. l) Ugyanaz, mint a k), de cinknitrát nélkül. Az enzimaktivitást meghatároztunk azonnal a fagyasztva szárítást követően, majd 22 hét múlva. Az alábbiakban e két aktivitásmérés eredményeinek összehasonlítását közöljük úgy, hogy a 22 hét elteltével mért enzimaktivitást a fagyasztva szárítás után azonnal mért enzimaktivitás %-ában adjuk meg: (a) 94 (b) 0 (c) 91 (d) 0 (e) 90 (0 0 (g) 88 (h) 0 (0 85 0) 0 00 82 (1) 0 Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás peroxidázt tartalmazó készítmények stabilizálására, azzal jellemezve, hogy a készítményekhez egy többértékű fémiont adunk, és a kapott készítményt adott esetben lioflizáljuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az illető fémiont tartalmazó vegyületet legalább 0,0001 mólos mennyiségben adjuk a készítményhez. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy fémvegyületként egy vas-sót használunk. 4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a fémvegyületet milliliterenként 1 nanogramm és 25 mikrogramm közötti mennyiségű peroxidázt tartalmazó készítményhez adjuk. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a peroxidázt tartalmazó készítményt liofilizáljuk. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a készítményhez kelátképző anyagot, előnyösen valamilyen amino-polikarbonsavat, hidroxikarbonsavat, polifoszfátot vagy metafoszfátot adunk. 7. Peroxidáz-tartalmú készítmény, azzal jellemezve, hogy stabflizálószerként egy többértékű fémiont tartalmaz. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
