174967. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ribo- és 2'-dezoxiribo-nukleozid-5'-polifoszfátok előállítására
5 174967 6 míg a morfolidát oldatban marad. A reakció lejátszódása után (pl. vékonyrétegkromatográfiás ellenőrzés) az elegyet lehűtjük, a diciklohexilkarbamidot szüljük, majd a morfolidátot éténél stabil, kristályos alakban kicsapjuk. Ily módon egyetlen adagban több kilogramm morfolidát is gyártható, amely a további reakcióhoz közvetlenül felhasználható, de szobahőmérsékleten évekig is tárolható. A foszforilezési reakciót célszerűen úgy hajtjuk végre, hogy a morfolidátnak a találmány szerinti oldószerpárban készült oldatát erőteljes keverés közben 5-10 óra alatt csepegtetjük a (IV) általános képletű foszforsav tributilammónium sóját a morfolidátra számítva legalább ötszörös mólarányban tartalmazó oldatához. Ilyen körülmények között nem alakulhat ki káros mellékreakcióknak kedvező nagy lokális morfolidát koncentráció, ezért a reakció egységes végtermékhez vezet. A reakció befejeztével (ellenőrzés pl. vékonyréteg elektroforézissel) az oldatot vákuumban eredeti térfogatának 40—50%-ára töményítjük be. A visszanyert oldószer további reakciókban közvetlenül felhasználható. A betöményített szirupot vízben feloldjuk, majd 0 és -5 ®C közötti hőmérsékletre lehűtve és 8—10,5 normál nátrium-hidroxid oldatot adagolva a szervetlen foszfátokat kicsapjuk, és az egyidejűleg felszabaduló tributilamint a vizes fázistól elválasztjuk. Ezután -5 és -10 ®C közötti hőmérsékletre hűtve és további 8—10,5 normál nátrium-hidroxid oldatot adagolva kiválik a 4-morfolino-N,N’-diciklohexilkarboxamidin bázis, ezt szűréssel eltávolítva a vizes oldat a megfelelő nukleotidot nátriumsó alakjában tartalmazza. Tömény sósavval a kívánt pH-értékre történő savanyítás után metanollal a difoszfátokat mono- és dinátriumsó, a trifoszfátokat di- és trinátriumsó alakjában tudjuk kicsapni. A kapott termékek az előírt analitikai követelményeknek megfelelnek, további tisztításukra nine? szükség. A kapott nátriumsókat kívánt esetben a szakmában ismert módon ciklohexilamin vagy diciklohexilamin sókká alakíthatjuk. A korábbi módszerekkel összehasonlítva a találmány szerinti eljárás előnye, hogy a nuldeozid-5’-polifoszfátok gyorsabban, jó hozammal és tisztán állíthatók elő. További előny, hogy a reakció egyszerű műveletekkel ipari méretekben is végrehajtható és kiküszöböli a korábban szükséges időigényes oszlopkromatográfiás elválasztást. A kapott nukleotid készítmények közvetlenül alkalmasak enzimrendszerekkel végzett munkára, pl. ribonukleozid-5’-difoszfátokból polinukleotid-foszforilázzal elkészíthetők a megfelelő poli-ribonukleotidok, mint a poli A, poli C, poli U stb. A találmány szerinti eljárást az alábbi kiviteli példákkal szemléltetjük. 1. példa Adenozin-5 ’-foszformorfohdát 348 g (1 mól) adenozin-5’-monofoszforsavat 1200 ml vízmentes metanolban szuszpendálunk. Keverés közben 340 ml (4 mól) morfolint adunk hozzá, amelynek hatására az adenozin-5’-monofoszforsav oldatba megy. Az oldathoz erős keverés közben a reakcióelegy forráshőmérsékletén 412 g (2 mól) 600 ml abszolút metanolban oldott diciklohexilkarbodiimidet csepegtetünk hozzá. A reakció lejátszódása után a reakcióelegyet 0 °C-ra hűtjük, majd a kivált diciklohexilkarbamidot kiszűrjük. A szűrletet vákuumban 600 ml-re bepároljuk. A bepáriási maradékot éterrel telítjük, majd ezt az oldatot csurgatjuk erős keverés közben 12 000 ml éterbe, amikor az adenozin-5 ’-foszformorfolidát kristályos formában kiválik. Szűrés és éterrel történő mosás után foszfor-pentoxid felett szobahőmérsékleten vákuumban szárítjuk. A termék vékonyréteg kromatográfiásan homogén (Silicagel Hp 254 rétegben 7:1:2 arányú izopropanol-tömény ammónium-hidroxid-víz eleggyel futtatva), a hozam 650—700 g (az elméletinek 89—96%-a). Xmax=257 pH=2 értéken (megegyezik az irodalomban megadott értékkel). 2. példa Adenozin-S’-trifoszformorfolidát 65 g (0,1 mól) adenozin-5 ’-trifoszfát nátriumsót feloldunk 600 ml vízben. Ehhez az oldathoz 400 ml Amberlite IR 120 (H*) kationcserélő gyantát adunk 0 °C- on, majd 5 perc keverés után a gyantát az oldatból kiszűrjük. A gyantát desztillált vízzel addig mossuk, amíg a mosóvíz pH-ja a 4-et el nem éri. A szűrlet pH-ját ezután morfolinnal 8,5-re állítjuk be, majd az oldatot 40 °C-on vákuumban bepároljuk, a bepáriási maradékot abszolút etanollal (400 ml) szárítjuk. A bepáriási maradékot 600 ml metanolban oldjuk és 24 ml (0,4 mól) morfolint adunk hozzá. Az így nyert oldathoz 50—55 °C hőmérsékleten erőteljes keverés közben lassan hozzácsepegtetjük 83 g (0,4 mól) díciklohexilkarbodiimid 100 ml metanollal készült oldatát. A reakció lejátszódása után az oldatot 0 °C alá hűtjük, majd a kivált diciklohexilkarbamidot kiszűrjük. A szűrletet vákuumban 50 °C-on 300 ml-re pároljuk be, majd éterrel telítjük. Ezt az oldatot lassan 3000 ml éterhez csurgatjuk erős keverés közben, amikor az adenozin-5’-trifoszformorfolidát kristályos formában kiválik. Szűrés és éterrel történő mosás után foszfor-pentoxid felett szobahőmérsékleten vákuumban szárítjuk. A termék vékonyrétegkromatográfiásan homogén (Silicagél HF 254 rétegen 7:1:2 arányú izopropanoltömény ammóniumhidroxid-víz eleggyel futtatva), a hozam 110-130 g (az elméletinek 85—99%-a). Xm a x — 257 pH = értékén. 3. példa Citidin-5 ’-difoszforsav-dinátriumsó 258 g (0,5 mól) tributilammóniumortofoszfátot feloldunk 100 ml metanol és 1300 ml acetonitril oldószerelegyben. Ezt az oldatot 60 °C-ra melegítjük és a keverést megindítva 7—8 óra alatt hozzácsepegtetjük 68,5 g (0,1 mól) citidin-5’-foszformorfohdát 100 ml metanollal és 200 ml acetonitrillel készült oldatát. A becsepegtetés után még 8—10 órás utókeverést végzünk 35—40 °C-on, majd a reakcióelegyet vákuumban 40 °C-on eredeti térfogatának 40%-ára bepároljuk. Az így nyert bepáriási maradékot 500 ml 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
