174967. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ribo- és 2'-dezoxiribo-nukleozid-5'-polifoszfátok előállítására
3 174967 4 C. S. 81, 1265 (1959)]. Emellett az alkalmazott amin és a DCCI között lejátszódó és a megfelelő diciklohexükarboxamidinium sóhoz vezető mellékreakcióval kell számolni, amely annál jobban előtérbe lép, minél nagyobb az alkalmazott amin bázicitása. Mindezek figyelembevételével az optimális körülményeket a morfolin szolgáltatta, a reakciót víz-terc-butanol (1:2,5) elegyben végrehajtva kvantitatíve a megfelelő nukleozid-5’-foszformorfolidát keletkezik 4-morfolino-NjN’-diciklohexilkarboxamidinium só formájában [Moffat J. G., Khorana H. G.: J. A. C. S. 83, 649 (1961)]. A kapott foszformorfolidátokat megfelelő oldószerben ortofoszfáttal vagy pirofoszfáttal reagáltatva nukleozid-5’-difoszfátok, illetve -trifoszfátok keletkeznek, pl. abszolút piridines közegben AMP-morfolidátból és bisz-tributilammónium-pirofoszfátból kiindulva ATP-hez jutottak. Bár fenti reakciómenet alkalmas a kétszer és háromszor foszforilezett nukleozidok előállítására, több hátránnyal is rendelkezik. Mivel a morfolidátképződési reakciót víztartalmú közegben hajtják végre, a feleslegben maradó DCCI eltávolítása többszöri éteres extrakciót igényel. Kisebb méretekben ez nem okoz nehézséget, de ha a morfolidát intermediert többszáz grammos, sőt kilogrammos nagyságrendben kívánjuk előállítani, a 20—30 liter vizes oldat többszöri éteres extrakciója veszélyes és költséges művelet, az ezt követő bepárlás pedig idő- és energiaigényes. A foszforilezési reakcióképzésben pedig a nemkívánatos p1 p2 - -diadenozil-polifoszfátok képződésének elkerülésére Moffat és Khorana hiába alkalmazza a pirofoszfát komponens tízszeres feleslegben a morfolidáthoz képest, a már keletkezett nukleozid-trifoszfát koncentrációja egyre csökken, és végül csak difoszfát mutatható ki a reakcióelegyben. Ennek oka az, hogy a képződött nukleozid-5’-trifoszfát elegendő morfoditátot talál a reakcióelegyben, hogy a p1 p2-dinukleozid-tetrafoszfátot létrehozza, amely piridin oldószerben diszmutációs reakcióban elbomlik, és két molekula nukleozid-5’-difoszfáttá alakul. A diszmutációs reakció kiküszöbölésére Moffat [Can. J. Chem. 42, 599 (1964)] vízmentes dimetilszulfoxid oldószert ajánlott, amelyben a reagenseket összemérve szobahőmérsékleten állni hagyja. Mivel azonban a morfolidát koncentrációja akkor is elég nagy, amikor a di-, illetve trifoszfátok már nagyobb mennyiségben keletkeznek, szimmetrikus vagy aszimmetrikus dinukleozid-5’-polifoszfátokat eredményező mellékreakciók ilyen körülmények között is lejátszódnak, az oszlopkromatográfiás tisztítás tehát ennél az eljárásnál sem mellőzhető. További hátrány, hogy a hosszadalmas eluálást követő bepárlás során a termékek könnyen bomlást szenvedhetnek. A találmány célja olyan eljárás kidolgozása ribo- és 2 ’-dezoxiribo-nukleozid-5 ’-polifoszfátok előállítására, amely az éteres extrakció kiküszöbölésével és az egyszerű műveletekkel nagymennyiségű morfolidát intermedier készítését teszi lehetővé, továbbá a foszforilezési reakcióban a mellékreakciókat kizáró reakciókörülményeket biztosít, ezáltal feleslegessé teszi a termékek oszlopkromatográfiás elválasztását. A találmány alapja az a felismerés, hogy a morfolidát képződési reakciót vízmentes 1-4 szénatomos alkanol oldószerben végrehajtva az N,N’-diciklohexilkarbamid szűrése és a reakcióelegy betöményítése 2 után a morfolidátok éterrel kristályos alakban kicsaphatók. A találmány alapja az a további felismerés, hogy a morfolidátok kis részletekben adagolva a foszforilező foszforsavszármazékhoz és ezt a reakciót vízmentes tetrahidrofurán, ortohangyasavas-etilészter vagy acetonitril és dimetilformamid, metilcelloszolv, formamid, dimetilszulfoxid vagy metanol elegyében végezve a mellékreakciók kizárásával a kívánt polifoszfátok képződnek, amelyek a reakcióelegyből könnyen kinyerhetők. A találmány szerint az (I) általános képletű ribo- és 2’-dezoxiribo-nukleozid-5’-polifoszfátokat, amelyekben R’ az adenin, guanin, hipoxantin és xantin purinbázisok vagy a citozin, uracil és timin pirimidinbázisok egyikét, továbbá e pirimidinbázisok 5-helyzetben halogénatomot tartalmazó származékát, R hidrogénatomot vagy hidroxil-csoportot, A hidroxil- vagy H2P04-csoportot jelent és n értéke 0,1 vagy 2, ha A hidroxil-csoport és 0 vagy 1, ha A H2P04-csoport, valamint e vegyületek sóit úgy állítjuk elő, hogy valamely (II) általános képletű ribo- vagy 2’-dezoxiribo-nukleozid-5’-foszfátot, ahol R’, R és n a fenti jelentésű, vízmentes 1—4 szénatomos alkanolban morfolinnal és N,N’-diciklohexilkarbodiimiddel reagáltatunk, az N,N’-diciklohexilkarbamid önmagában ismert módon való eltávolítása után a reakcióelegyet betöményítjük, és a kapott (III) általános képletű nukleozid-5’-foszformorfolidátot, ahol X 4-morfolino-csoportot, B+ 4-morfolino-N,N,-diciklohexilkarboxamidinium kationt jelent, R’, R és n pedig a fenti jelentésű, éterrel kicsapjuk és közvetlenül vagy kívánt esetben elkülönítés után vízmentes tetrahidrofurán, ortohangyasavas-etilészter vagy acetonitril oldószerek egyikéből és dimetilformamid, metilcelloszolv, formamid, dimetilszulfoxid vagy metanol oldószerek egyikéből álló oldószerpárban oldva 20—60 8C-on 5-10 óra, előnyösen 7—8 óra alatt keverés közben részletekben valamely (IV) általános képletű foszforsav, ahol A a fenti jelentésű, tributilammóniumsójának az előbbi oldószerpárban készült oldatához adagoljuk, és az adagolás után 10:1 és 4:1 közötti térfogatarányú oldószerpárban oldott reakcióelegyet 20—40 8C-on további 5—10 óra, előnyösen 7-8 óra hosszat keverjük, a reakcióelegyet betöményítjük, majd a kapott (I) általános képletű nukleozid-5 ’-polifoszfátot, ahol R’, R, A és n a fenti jelentésű, vízben oldjuk, a szennyező anyagokat 0 és -10 °C közötti hőmérsékleten 8—10,5 normál nátrium-hidroxid oldattal szükség esetén több lépésben kicsapjuk és elválasztjuk, végül a vizes oldatból az (I) általános képletű ribo- vagy 2’dezoxiribo-nukleozid-5’-polifoszfát, ahol R’, R, A és n a fenti jelentésű, nátriumsóját ismert módon kristályos állapotban kinyerjük, és kívánt esetben önmagában ismert módon e savból a szabad savat felszabadítjuk vagy e sót más sóvá alakítjuk. A morfolint és az N,N’-diciklohexilkarbodiimid alkanolos oldatát a (II) általános képletű kiindulási anyag alkanolos oldatához vagy szuszpenziójához keverés közben adagoljuk, a reakciót célszerűen a reakcióelegy forráshőmérsékletén hajtjuk végre. Oldószerként vízmentes 1—4 szénatomos alkanolt, előnyösen metanolt használunk. A reakció előrehaladtával az NyN’-diciklohexilkarbamid a reakcióelegyből kiválik, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
