174894. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kinetikus szubsztrátmeghatározásra és reagens ennek kivitelezéséhez
3 174894 4 A fent idézett közleményekben és más munkákban [Keller, Chemische Rundschau, 26, 24. és 29.0., (1973) és Bucolo, Clin. Chem. Vol. 21, Nr. 3., 424—426. oldal. (1975)], amelyek eddig a kinetikus szubsztrátmeghatározással foglalkoztak, elsősorban az eljárás egylépcsős reakciókra való alkalmazhatóságát tárgyalják. Ilyenfajta reakciók azonban csak korlátozott jelentőségűek. Ugyanis főként arra van szükség, hogy a tesztrendszereket széles specifitás és alkalmazhatóság érdekében több részreakcióból állítsák össze. Másrészt nem ismeretes, hogyan kell ilyenfajta kapcsolt tesztrendszereket úgy felépíteni, hogy velük rutinkörülmények között szubsztrátkoncentrációkat kinetikus alapon tudjanak meghatározni. Ellenben legújabban még arra utalnak, hogy a kapcsolt reakciók a kinetikus meghatározásokat problematikussá teszik [Chem. Rundschau, 26. 24 (1973)], mert például résztvevő enzimek aktivitáscsökkenése az eljárást gyorsan használhatatlanná teszi. Ezért voltak mindeddig azon a nézeten, hogy egy egylépcsős eljárást éppen enzimkinetikus szubsztrátméréseknél a kétlépcsőssel (és ennek megfelelően általában a többlépcsőssel) szemben előnyben kell részesíteni. Ez magyarázza, hogy miért nem váltak be eddig a gyakorlatban olyan kapcsolt tesztrendszerek, amelyekkel rutinkörülmények között szubsztrátkoncentrációkat kinetikusán határozhatnak meg. A találmány feladata ezért az, hogy szubsztrátkoncentrációk kapcsolt reakciók segítségével kinetikus alapon történő meghatározására egy olyan eljárást bocsásson rendelkezésre, amely rutinkörülmények között kivitelezhető, és amelynél a többlépcsős tesztrendszer részlépései egészben vagy részben enzimkatalízissel mennek végbe. Ezt a feladatot a találmány szerint enzimszubsztrátumok kapcsolt reakciók segítségével történő kinetikus meghatározására szolgáló olyan eljárással oldjuk meg, amelyet az jellemez, hogy a reakcióparamétereket úgy választjuk meg, hogy a reakciólánc specifikus részreakciója az egész reakcióláncra sebességmeghatározó legyen, és a sebességmeghatározó lépés első rend vagy pszeudo-első rend szerint menjen végbe. Kapcsolt reakciókon itt legalább két részreakcióból álló sorozatot értünk, amelyek közül legalább egy enzimatikusan katalizált, és amelyeknél a szubsztrát átalakulása és a tulajdonképpeni mérőreakció (indikátorreakció) különböző reakdólépésekben megy végbe. A legspecifikusabb részreakciót sebességmeghatározóvá és első rend szerint végbemenővé alakító lehetőségekhez tartozik az alkalmazott enzim fajtájának alkalmas kiválasztása, egy vagy több alkalmazott enzim Michaelis állandójának mesterséges megváltoztatása, a szubsztrát változtatásai, a résztvevő enzimek és reagensek koncentrációinak, a hőmérsékletnek és a pH-értéknek alkalmas megválasztása, kofaktorok, gyorsítók és gátló-szerek hozzáadása. A kevésbé specifikus részreakciót illetve a kevésbé specifikus részreakciókat előnyösen az ezen részreakciókban ható enzimek túladagolásával gyorsítjuk. Ennek a kivitelezési formának az a további előnye van, hogy kompenzálja ezeknek az enzimeknek a tárolás hatására bekövetkező aktivitásváltozását. A specifikus részreakció enziménél ezzel szemben aktivitáscsökkenés nem játszik lényeges szerepet, mert a Michaelis állandókat ez általában nem befolyásolja. Természetesen meg kell azonban gátolni, hogy ez az enzim teljesen elveszítse aktivitását, amire az enzimstabilizálás szokásos módszerei alkalmazhatók, amelyeket a szakember ismer. Túladagoláson itt legalább kétszer olyan mennyiségű, előnyösen legalább négyszer nagyobb enzimmennyiség hozzáadását értjük, mint amekkora a reakció gyors végbemeneteléhez szükséges lenne. A részlépésekhez alkalmazott enzimek megfelelő mennyiségeivel, mint előbb említettük, az egyes részreakciók sebességei jelentősen változhatnak, úgy hogy viszonylag egyszerű módon sebességmeghatározóvá tehető az a reakció, amely a legspecifikusabb lefutást mutatja. Az alkalmazott enzimek fajtája változtatható, mivel a kívánt Michaelis állandók szerint egy egészen biztos eredetű enzimet választhatunk ki. Különböző eredetű enzimek, amelyek ugyanazt a reakciót katalizálják, eltérő Michaelis állandókkal rendelkezhetnek aszerint, hogy például mikroorganizmusokból vagy emlősállatok májából állították-e elő őket. A Michaelis állandók mesterséges megváltoztatása például az enzim aktív centrumában levő fématom megváltoztatásával érhető el. Másik lehetőség az enzim részleges hasítása vagy részegységeinek disszociációjával - ha az enzim ilyenekből áll - vagy a peptidlánc egy részének proteolitikus lehasításával. További lehetőség az aktív centrum kémiai módosítása. Ez például a centrum aminosavai egyes reaktív csoportjainak megváltoztatása útján sikerülhet, például egy SH-csoport vagy hasonló oxidációjával. További lehetőség a Michaelis állandó mesterséges megváltoztatására az enzim konformációváltoztatása egy allosztérikus effektor hozzáadásával, bizonyos ionok hozzáadásával, a puffer fajtájának alkalmas megválasztásával, az oldatban bizonyos sókoncentrációk beállításával és hasonlókkal. Magának a szubsztrátnak a megváltoztatása történhet komplexképzéssel alkalmas komplexképzők hozzáadásakor, micellaképzéssel, például detergens hozzáadásával vagy hasonlókkal. A pH-értékkel is befolyásolható a reakciósebesség a találmány szerinti értelemben. így annak a részreakciónak az enzime, amelyet sebességmeghatározóvá akarunk tenni, egy nem optimális pH-értéknél alkalmazható, ami ezen enzim Michaelis állandójának növekedéséhez vezet. Hasonlóképpen enzimek hőmérsékletfüggősége is kihasználható, noha ez nem ajánlott, mert az általános törekvés az, hogy az enzimatikus meghatározási reakciók hőmérsékletét egységesítsék. További eszköz a találmány szerinti eljárásban a részreakciók sebességének befolyásolására a reakcióban résztvevő anyagok és reakciótermékek hozzáadása, amelyek egy enzim Michaelis állandóját valóban vagy látszólag megváltoztatják. Ugyanígy inhibitorok is alkalmazhatók. Ez utóbbi például a 2 349 819.3 számú Német Szövetségi Köztársaság-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
