174894. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kinetikus szubsztrátmeghatározásra és reagens ennek kivitelezéséhez
5 174894 6-beli nyilvánosságra hozatali iratból ismeretes. Végül egy nem enzimatikus rtszreakció sebessége katalizátor vagy gátló-szer hozzáadásával befolyásolható. A reakciólánc legspecifikusabb részreakcióján olyan részreakciót értünk, amely a reakció kiindulási anyagára vonatkozólag a legnagyobb specifitást mutatja, és ezenkívül a reakcióparaméterek megfelelő megválasztásával sebességmeghatározóvá tehető. Ez a részreakció lehet enzimatikusan katalizált, de nem kell ilyennek lennie. Példa egy nagyon nagy specifitású pszeudo-elsőrendű nem-enzimatikus reakcióra az a- és |3-glükóz közötti mutarotáció. Ha az önmagában legspecifikusabb részreakció nem tehető sebességmeghatározóvá, például az enzim túl kicsi valódi vagy látszólagos Michaelis állandója esetén, úgy a találmány értelmében a sebességmeghatározóvá tehető következő legspecifikusabb részreakció számít a legspecifikusabb részreakciónak. A találmány további lényeges felismerése az, hogy a sebességmeghatározó lépést úgy kell alakítani, hogy az első rend vagy pszeudo-első rend szerint menjen végbe. Ha a legspecifikusabb részreakció, amelyet sebességmeghatározóvá alakítunk, egyébként is első rend szerint megy végbe, úgy különösebb intézkedések ebben a vonatkozásban nem szükségesek. Más a helyzet másod- vagy magasabb rendű reakciók esetén. Itt pszeudo-első rendet kell előidézni. Ez azáltal érhető el, hogy a második vagy további reakciópartner (amely nem a meghatározandó szubsztrát vagy ennek terméke) koncentrációját megfelelő adagolással a reakció alatt gyakorlatilag állandónak tartjuk, tehát feleslegben alkalmazzuk. Azonkívül, ha enzimatikus reakcióról van szó, a Michaelis állandót olyan nagynak kell választani, hogy a vizsgálatban számításba jövő szubsztrátkoncentráció felső határához képest nagy legyen. A találmány tárgya továbbá egy reagens enzimszubsztrátumok kapcsolt enzimatikus reakciók segítségével történő kinetikus meghatározására. Egy ilyenfajta reagenst a találmány szerint az jellemez, hogy ez olyan enzimeket és reakciórésztvevőket és olyan adagolásban tartalmaz, hogy a szubsztrátnak a reagens vizes oldatához történő hozzáadásakor végbemenő reakciólánc legspecifikusabb részreakciója az egész reakcióláncra sebességmeghatározó legyen, és első vagy pszeudo-első rend szerint menjen végbe. A találmány egy előnyös kiviteli alakja szerint ezt azáltal éljük el, hogy a reagens a kevésbé specifikus részreakció vagy részreakciók enzimét vagy enzimeit túladagolva tartalmazza. A találmány lehetővé teszi, hogy enzimkinetikus szubsztrátméréseket kapcsolt tesztrendszerekben végezzük, és ezzel az ilyenfajta meghatározások kivitelezéséhez szükséges időt jelentősen csökkentsük. Egyidejűleg a résztvevő enzimek aktivitásától való messzemenő függetlenséget érünk el azáltal, hogy az eljárás pontossága akkor is teljes mértékben a megadott, ha a résztvevő enzimeknél a tárolás folytán már jelentős aktivitáscsökkenés lépett fel. Továbbá lehetővé teszi a találmány, hogy ilyenfajta többlépcsős enzhnkinetikus szubsztrátméréseket minden használatos analizáló automatán végezhessünk, mivel a találmány alapján nehézségek nélkül lehetséges, hogy a reagensek mennyiségi összetételét minden tetszés szerinti analizáló automatához hozzáigazítsuk. A következő példák a találmányt bővebben megmagyarázzák. 1. példa Vércukormeghatározás a GOD/POD módszer szerint. A meghatározás a következő egyenletek szerint megy végbe: a—D—glükóz ^ ß-D—glükóz 37% 63% 0-D—glükóz + H20 + GÖD + 02 £ç j J 3 4 1 D-glükonsav + H2 02 H202 + fenol + 4-amino- POD-antipirin -» kinoidális EC.l .11.1.7. színezék +2 H20 A peroxidáz (POD) enzimet annyira túladagoljuk, hogy az a- és 0-glükóz között szigorúan pszeudo-első rend szerint végbemenő mutarotáció vagy a glükózt illetően a nagy KM miatt szintén pszeudo-első rend szerint végbemenő glükózoxidáz (GOD)-reakció sebességmeghatározó lépéssé válik. Ezt a következő összetételű reagenssel éljük el: 80—120 mmól 7,0 pH-jú foszfátpuffer, 0,8 E/ml vagy több POD, 12 E/ml vagy több GOD 0,60-1,80 mmól 4-amino-antipirin, 3,0-13,5 mmól fenol. Az előbbi reagens különösen az eljárás centrifugál gyors analizátorokon történő kivitelezésére alkalmas. Az első leolvasás a reagensnek a vizsgálandó mintával való összekeverése után körülbelül 35 másodperccel történik, a második leolvasás 1,5-3,5 perccel később. A reakcióelegy 500—600 pl-ével és 5-20 pl mintával lOOOmg/lOOml koncentrációig határozható meg vércukor. Részletes előírások az Electro-Nucleonics Inc. GEMSAEC elnevezésű gyors elemzőkészülékével végzett vércukormeghatározáshoz: A meghatározás a fenti egyenletek alapján történik. A vizsgálathoz szérum, heparin- vagy citrát-plazma alkalmazható, mely +4 °C hőmérsékleten 4 órán keresztül tárolható. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
