174891. lajstromszámú szabadalom • Eljárás enzimatikus átalakítások végrehajtására vizes közegből apoláros folyadékokkal elválasztható enzimkészítményekkel
13 174891 14 nyék között végezzük a centrifugálást, amelyet újraszuszpendálás és ismételt centrifugális követ, így egy barna üledéket kapunk, melynek nedves súlya 8 g. Ezt kitűnően flotálhatjuk n-dekanollal, vagy kevésbé jól n-heptánnal. Az ilyen módon kapott aktivitásokat a 3. táblázat mutatja. A kapcsolt enzimben az eredeti enzim aktivitásának közelítőleg 10%-a van jelen. 3. táblázat PAT 2 000 HDDG—1 aktivitása Vizsgálati módszer: 1. előbb, minden esetben 5 súly^os Penicillin G-t használunk. 6-APS-termelés Anyag Mennyiség értéke mól/perc 10"4 Eredeti enzim 1 ml 0,875 PAT 2 000 HDDG-1 Felső fázis 1 ml 0,022 PAT 2 000 HDDG-1 újravizsgálat (2. vizsgálat) 0,5 g 0,155 4. példa a) n-Decilamino, (6-amino-hexil-amino)-Sepharose 4B (SRHDD— 1) 2 g száraz súlyú, cián-bromiddal aktivált Sepharose—4 B-t 15 percen keresztül, 4°C-on 50 ml 10_3n sósavval duzzasztunk, és ezt követően zsugorított üvegszűrőn 2x100ml 10~3n sósav-oldattal mossuk. A kapott gélt 20 ml 0,1 M nátriumhidrogénkarbonát-oldat, 5 ml etanol, 0,5 g n-decil-amin és 0,1 g 1,6-diamino-hexán elegyéhez adjuk. Az így kapott elegyet 4 °C-on 16 órán át lassú ütemben keverjük és zsugorított üvegszűrőn szűrjük. A kapott gélt szívatás alatt 4x20 ml 10"3 n sósav-oldattal, 4 x 20 ml etanollal és 4 x 50 ml vízzel mossuk, majd azt követően ismét vízben szuszpendáljuk és 4 °C-on tároljuk. b) Penicillin-aciláz[n-decil-amin, (6-amino-hexilamin)-Sepharose 4 B] (PASRHDDG— 1 ) A leszívatással szárított SRHDD-1-gélt, melynek súlya 1,5 g (pH = 6-os) 0,1 M nátrium-foszfát pufferoldattal szuszpendáljuk, és ehhez 0,5 ml 25 súly%-os glutáraldehidet adunk. A keveréket 2 órán keresztül szobahőmérsékleten keverjük és zsugorított üvegszűrőn szívatással szárítjuk. Az így kapott gélt 2 ml, 13,6 mg penicillin-aciláz és 3 ml pH = 6-os 0,1 M nátrium-foszfát pufferoldat elegyével kezeljük. Az így kapott elegyet 24 órán át keverjük 4°C-on, szűrőre visszük, szárazra szívatjuk, és az üvegszűrőn 5x20 ml 7,0pH-jú 0,1 M nátrium-foszfát pufferoldattal mossuk. A terméket ugyanezen pufferoldat 5 ml-ével szuszpendáljuk. A kapott gyöngyszerű termék n-dekanollal flotálható ellentétben a nem-módosított Sepharose-zal, amely a vizes szuszpenzió üledékében foglal helyet. A kapott preparátum aktivitását a 4. táblázatban mutatjuk be. Hozzávetőlegesen az eredeti aktivitás 72%ra van jelen a preparátumban. 4. táblázat PASRHDDG-1 penicillin-aciláz aktivitása » Vizsgálati módszer: megegyezik az előzőben foglaltakkal: 5 súly% penicillin G-t használunk. 6-APS-termelés Anyag Mennyiség értéke mól/perc 10'4 Eredeti enzim 1 ml 0,885 PASRHDDG-1 2 ml 0,505 újravizsgálat 2. eljárás 1. 2 ml 0,410 2. 2 ml 0,375 1. eljárás 3. 2 ml 0,270 5. példa Tripszin-[n-oktadecil-amino, (6-amino-hexil-amino)-Ficoll] (TFODHDG-1) 50 mg, sómentes tripszint 20 ml 0,1 M (pH = 6 értéket biztosító) nátrium-foszfát pufferoldattal kezelünk 0 °C-on. Az oldathoz 1 ml 25 súly%-os glutáraldehidet adunk, és az elegyet 15 percen keresztül 0°C-on keverjük. Ezután az elegyhez 10 ml 2a) példa szerint készült FODHD-l-t adunk és az oldat pH-ját 6,2-re állítjuk 2n sósavoldattal. Az elegyet 16 órán át 4 °C-on i keverjük, majd 20 000 g értéken, 4 °C-on, 30 percen át centrifugáljuk. Az üledéket 20 ml vízben újra szuszpendáljuk, majd WHATMAN—IPS-fázisszűrőpapírral szűrjük. A maradékot 20 ml 10-3 M sósav-oldattal ismét szuszpendáljuk és elvégezzük a szűrést. A fenti, 10-3 M sósav-oldattal végzett szuszpendálást és centrifugálást [10 000 g (14 C) 20 perc] kétszer végezzük el, és így 2,65 g barna gélt kapunk. Ezt az anyagot mind n-dekanollal, mind n-heptánnal flotálhatjuk. A termék aktivitását az 1. ábrán láthatjuk. A tripszines bomlást az A görbe, a tripszin-TFODHG-1 komplexet (0,1 g) a B görbe szemlélteti, ahol az N-a-benzoil-DL-arginin-n-nitroanilidből felszabadult p-nitroanilin extinkciója látható az idő függvényében. A vizsgálati módszer a következő: N-a-Benzoil-DL-arginin-p-nitroanilint 5 ml dimetilformamidban oldunk, és az oldatot 45 ml 0,05 M trisz-pufferoldathoz (pH = 8,3) adjuk, mely 10 mM CaCl2-ot tartalmaz. Ekkor a kromogén szubsztrát 2xlO_3M oldatát kapjuk. Ehhez 5 ml n-heptánt adunk, és az elegyet 22 °C-on erélyesen keverjük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
