174891. lajstromszámú szabadalom • Eljárás enzimatikus átalakítások végrehajtására vizes közegből apoláros folyadékokkal elválasztható enzimkészítményekkel
15 174891 16 Az enzimmintát az elegyhez adjuk, és időközönként az elegyből 5 ml alikvot részt veszünk ki. Rövid állás után vagy gyenge centrifugálást követően a heptános fázist elválasztjuk (vele együtt a TFODHDG-l-et is). Az alsó vizes fázist kivesszük, és a felszabadított p-nitroanilin extinkcióját 1 cm-es küvettában 400 nm hullámhosszon (E^qq" nm) meghatározzuk. A heptán-cseppek egy szignifikáns elnyelési abszorpciós értéket adnak. Néhány esetben az alsó fázist hígítani kell, hogy elősegítsük abszorpció-leolvasását. Leolvasás után mind a heptános fázist, mind az alsó, vizes fázist visszahelyezzük a reakcióelegyhez. A konjugát teljes aktivitása az eredeti amidolitikus aktivitás 17%-a. 6. példa Lipáz- [ n-de cil-amino, ( 6-amino-hexil-amino)-Dextrán T 2000] (LT 2000 HDDG-1) Candida Cylindracea lipáz 200 mg-ját 20 ml 0,1 M (pH = 6,0 érték) nátrium-foszfát pufferoldatban oldjuk, majd a pH-t 6,2-re állítjuk, az oldathoz 2 ml 23 súly%-os glutáraldehidet adunk, és az elegyet 30 percen keresztül szobahőmérsékleten keverjük. A 3. példában ismertetett módon készített T 2 000 HDD-1-et etanolos szuszpenzióból ülepítjük, majd vízben duzzasztjuk. Az ilyen módon kapott gél lOg-ját 20 ml 0,1 M (pH = 6 értékű) nátrium-foszfát pufferoldattal homogenizáljuk és hozzáadjuk az enzim-glutáraldehid-elegyhez. A pH-t 6,2-re állítva az elegyet 4°C-on, 16 órán keresztül keverjük. A szuszpenziót 20 000 g értéken 4°C-on, 30 percig centrifugáljuk, 50 ml 0,1 M (pH = 6 értékű) nátrium-foszfáttal újraszuszpendáljuk és ismét centrifugáljuk. A végső terméket (8,4 g nedves súlyú) 20 ml 0,1 M (pH = 7,0 értékű) nátriumfoszfát pufferoldattal szuszpendáljuk. A kapott aktivitás értékeket a 2. ábrán láthatjuk. Az A görbe a lipázos (0,1 g), a B görbe az LT 2000 HDDG-1 lipáz-komplexes (420 mg) bontást szemlélteti, ahol a felszabadult p-nitrofenil-laurát extinkciója látható az idő függvényében. A meghatározásként használt vizsgálati módszer a következő: 5 ml p-Nitrofenil-laurát 10'2 M heptános-oldatát szobahőmérsékleten gyors keverés közben egyesítjük 20,0 ml 0,1 M (pH = 8 értékű) nátrium-foszfát pufferoldattal. Ezen körülmények között 1 óra elteltével a nem-enzimes-észter hidrolízise kimutathatatlan. Az enzim beadagolást követően, megfelelő időközönként 5 ml alikvot részt veszünk, melyet 4000 g értéken 1,5 percen át centrifugálunk. Az alsó vizes fázist visszatartjuk, és extinkcióját pontosan 3 perccel a mintavétel után megvizsgáljuk, E\0C(T mm értéken. A vizsgálat után a vizes és heptános fázisokat visszahelyezzük a reakcióelegybe. (Mivel a szubsztrát a nem-vizes-fázisban foglal helyet, ebben a kísérletben a diszperzitás fokát, a keverés mértékét a kísérlet folyamán állandónak kell tartani.) Az eredeti lipáz-aktivitás közelítőleg 1%-a van jelen a készítményben. a) GAN 149 HDOD-1 lg n-oktadecil-amint és 0,2g 1,6-diamino-hexánt 10 ml metanolban szuszpendálunk, és hozzáadjuk 200 ml 0,2 M (pH = 8 értékű) nátrium-foszfát pufferoldathoz, mely 40 ml metanolt tartalmaz. Az elegyhez erőteljes keverés közben 2 g GANTREZ 149-et adunk, kis részletekben. Az elegyet 16 órán át szobahőmérsékleten keverjük és ezután 12 000 g értéken 1 órán keresztül, szobahőmérsékleten centrifugáljuk. A felső fázist és a habot eltávolítjuk, és az üledéket 100 ml 0,1 M (pH = 7 értékű) nátrium-foszfát pufferoldattal újra szuszpendáljuk, majd az előbbi módon centrifugáljuk. A kapott 80 g gélszerű üledéket 4°C-on tároljuk. b) PAGAN 149 HDOD-1-G 20 ml 1,36x10"7 egységű, 136 mg protein-tartalmú penicillin-aciláz-oldat pH-ját 6,2-re állítjuk be, majd az oldathoz gíutáraldehid 2 ml 25 súly%-os vizes oldatát adjuk. Az elegyet szobahőmérsékleten keverjük, és 10 g GAN 149 HDOD—1-et tartalmazó 12 ml 0,1 M nátrium-foszfát (pH = 6 értékű) pufferoldatot adunk hozzá. A pH-t 6,2 értéken tartjuk, és a keverést szobahőmérsékleten 2 órán át folytatjuk. A szuszpenziót 1 órán át 20 000 g értéken centrifugáljuk 4 °C-on, és ilyen módon 14 g üledéket kapunk. Az üledéket 10 ml 0,1 M (pH = 7 értékű) nátrium-foszfát oldattal újra szuszpendáljuk, és a centrifugálást megismételjük. A végső terméket 4 °C-on tároljuk. Specifikus aktivitás: 3x 10 5 * mól 6-APS perc"1 (5% penicillin G, pH = 7,8, 22 °C) Visszakapott aktivitás: 21% Flotálható n-dekanollal vagy n-dekánnal. 7. példa 8. példa a) GAN 149 HDOD-2 5 g n-oktadecil-amint 50 ml etanolban oldunk, és az oldatot 1 liter 0,1 M (pH = 9 értékű) nátrium-foszfát pufferoldathoz adjuk, amely 200 ml etanolt tartalmaz. Ehhez az elegyhez 3/4—1 órás keverés közben 5 g GANTREZ 149-et adunk kis részletekben. A pH-értéket 2 n nátrium-hidroxid-oldattal 8 és 9 közötti értéken tartjuk. A GANTREZ-adagolást követően 5 g 1,6-diaminohexánt juttatunk az elegybe, amelyet azután szobahőmérsékleten 6 órán át keverünk. Ezután tömény sósavval a pH-t 3-as értékre állítjuk, majd a szuszpenziót 12 000 g értéken, szobahőmérsékleten 1 órán át centrifugáljuk. A felső fázist eltávolítjuk, a maradékot 550 ml vízben újra szuszpendáljuk és centrifugáljuk, ilyen módon 150 g finom fehér üledéket kapunk, melyet 4°C-on tárolunk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
