174891. lajstromszámú szabadalom • Eljárás enzimatikus átalakítások végrehajtására vizes közegből apoláros folyadékokkal elválasztható enzimkészítményekkel
174891 12 11 az aktivitásértéket a keletkező 6-APS (6-aminopenicillánsav) képződésének mértékével fejezzük ki. Az 1. újravizsgálatban 2 ml n-dekanolt adunk a kevert reakcióelegyhez, a meghatározás után a szuszpenziót hagyjuk két fázisra szétválni. A felső fázist egy fecskendővel távolítjuk el és ismét felhasználjuk. A 2. vizsgálatban a végső szuszpenziót 2000 g/15 perc értéken centrifugáljuk és az üledéket újra használjuk. 1. táblázat 10 nátriumfoszfát pufferoldattal újra szuszpendáljuk, a szuszpenziót 4 °C-on tároljuk. A szuszpenziót hatékonyan flotálhatjuk n-dekanollal. Az aktivitás-értékeket a 2. táblázat mutatja. A visszanyert aktivitás közelítőleg 60%. 2. táblázat PAFODHDG—1 aktivitása Vizsgálati módszer: megegyezik az 1. táblázat előtt ismertetett módszerrel. Minden esetben 5 súly%-os penicillin G-t használunk. 00 'O « « E « 2 5 % u 6—APS képződés g .o C/î 'O % Anyag Mennyiség értéke c c _>* a. E5 mól/perc 10"4 Anyag s £'3 vb E 20 Eredeti enzim 1 ml 5 0,885 Eredeti enzim 1 ml 0,885 PAFHDDG—1 PAFODHDG-1 0,5 g 0,940 felső fázis 1 ml 5 0,008 újravizsgálat PAFHDDG-1 0,5 g 5 1,500 (2. vizsgálat) újravizsgálat 25 1. 0,5 g 0,800 1. eljárás 1. 0,5 g 5 0,860 2. 0,5 g 0,585 g 2. 0,5 g 5 0,550 3. 0,5 g 5 0,500 2. eljárás 1. 0,5 g 5 1,300 3. példa 2. 0,5 g 5 1,210 30 3. 0,5 g 5 1,110 a) n-Decil-amino, (6-amino-hexil-amino)-4. 0,5 g 5 1,030-Dextrán T 2000 (T 2000 HDD-1) 2. példa 35 a) n-Oktadecil-amino, (6-amino-hexil-amino)-Ficoll (FODHD-1) 5 g Ficoll-t 300 ml vízben feloldunk, az oldatot 40 1 g cián-bromiddal pH = 11,0 értéken kezeljük az 1. példában leírt módon. 20 perc után 2 n sósavval a pH értéket 10,0-ra állítjuk be. Ezután S g n-oktadecil-amin és 0,5 g 1,6-diamino-hexán 20 ml metanolos oldatát adjuk az elegyhez. A pH-t ismét 45 10,0 értékre állítjuk 2n sósavval és az elegyet 4 °C-on 72 órán át keverjük. A terméket 20 000 g értékben, 4 °C-on 45 percig centrifugáljuk. A maradék egy laza fehér üledék (25 ml) és egy némi habréteget (oktadecilamin) alkotó tiszta felső fázis, so b) Penicillin-aciláz (n-oktadecil-amino), (6-amino-hexil-amino)-Ficoll (PAFODHDG-1) 55 Penicillin-aciláz (25 ml, 170 mg protein) pH-ját szobahőmérsékleten 6,2 értékre állítjuk, és az oldathoz 2,5 ml 25 súly%-os glutáraldehidet adunk. Az elegyet szobahőmérsékleten 15 percig keverjük, go majd 10 ml FODHD—1-et adunk hozzá, és a kapott szuszpenzió pH-ját 2 n sósavval pH = 6,2 értékre állítjuk. 4 °C-on 3 órán át keverjük, majd az anyagot 20 000 g értéken, 4 °C-on 30 percig centrifugáljuk. A rózsaszín üledéket 0,1 M (pH = 7-es) 65 10 g dextránt (átlag-molekulasúly 2 000 000) 800 ml vízben oldunk és az előző példákban leírt módon 2,5 g cián-bromiddal aktiváljuk. 20 perc után 5 g n-decil-amin és 1,0 g 1,6-diamino-hexán elegyét adjuk az oldathoz, és a pH-t 10-es értékre állíljuk. Az oldatot 16 órán keresztül 4 °C-on keverjük, ezután 20 000 g értéken, 4 °C-on, 1,5 órán át centrifugáljuk. A kapott üledéket 100 ml 0,1 n sósavval újra szuszpendáljuk, és ismét centrifugáljuk (20 000 g/1 órán át). A második üledéket visszatartjuk (körülbelül 50 g nedves súly). b) Penicillin-aciláz [n-decil-amino-, (6-amino-hexil-amino) dextrán T 2 000] (PAT 2 000 HDDG-1) 10 g nedves súlyú T 2 000 HDD-l-t pH = 6-os 0,1 M nátriumfoszfát pufferoldattal homogenizálunk, és a szuszpenzió pH-ját 6,2-re állítjuk. Penicillin-aciláz (50 ml, 340 mg protein) pH-ját 6,2-re állítjuk be, és 5 ml 25 súly%-os glutáraldehidet adunk hozzá. Az oldatot 45 percen keresztül 4°C-on keverjük, és ezután adjuk az elegyhez a T 2000 HDD-t. Az elegyet 4 °C-on 30 percig keverjük, és ezt követően —20 °C-on 16 órán át tartjuk. Kiolvadás után a szuszpenziót szobahőmérsékleten 1 órán át keverjük, és 6 000 g értéken 22°C-on 30 percig centrifugáljuk. A felső fázist félretesszük és az üledéket 75 ml (pH = 7 értékű) nátrium-foszfát-pufferoldattal újraszuszpendáljuk és homogenizáljuk. Az előbbihez hasonló körülmé6
