174887. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gonococcus szálak előállítására
13 174887 14 szolubilizált, különálló GC szál pálcikákat kapunk. Ennél a közegnél szükséges lehet a pH-érték megnövelése, vagy a pH-érték változatlanul is hagyható. Ha a szolubilizálást a pH-értél megváltoztatásával kell elérnünk, alkalmas, eléggé magas pH-értékű pufferoldatot adunk a maradékhoz. Kívánatos, hogy a puffer pH-értéke 9,3—11 között, előnyösen 10,0-10,4 között legyen. Nagyobb pH-értékek esetén fennáll a peptidek denaturálódásának a veszélye. A jelzett pH-tartományban szolubilizálódnak, a Ti és T2 szál kristályok. Ha a Ti szálakat el akarjuk különíteni az eredeti szilárd szemcsében, jelenlevő T2 szálaktól, a pufferoldat pH-értékét úgy állítjuk be, hogy kezdetben 7,7 felett, azonban 9,3 alatt legyen. A szuszpenziót ezután centrifugáljuk, és a folyadék tisztáját félretesszük vagy elöntjük az eljárás kívánalmainak megfelelően. Ha az eredeti szilárd szemcse feltehetően jelentős mennyiségben tartalmaz T2 típusú szálakat, nagyobb pH-értékű, nevezetesen 9,3 feletti pH-értékű friss pufferoldatot adunk hozzá, amely oldószerfázist képez. Ez az oldószerfázis tartalmazza a T2 szálakat, mentes azonban a Ti típusú szálaktól. Az ennél a lépésnél alkalmazott pufferoldat tényleges összetétele nem kritikus, bár különösen előnyös a trisz-tartalmú fiziológiás konyhasó. A találmány szerinti eljárás mindkét fenti változatánál az összes szilárd anyaghoz olyan pufferoldat-térfogatot adunk, amely közelítőleg háromszorosa a szilárd anyagok térfogatának. Ez a mennyiség sem kritikus azonban, mindössze elégségesnek bizonyult a GC szál anyag feloldásához, anélkül, hogy túlzottan nagy térfogatú vizes közeget használnánk. Ha a szálak felületi tenyészetből származnak, és az említett felületi tenyészetet egy harmadik, magas pH-jú mosásnak vetettük alá hasonló pufferoldattal, ennél a fázisnál hozzáadhatjuk ezt a mosófolyadékot a vizes közeghez. A szemcsét ezután a vizes közegben szuszpendáljuk. Nem kritikus a szemcse szuszpenzióba vitelének módja: kézzel végzett keverés vagy pipettázás, keverőgéppel vagy mágneses keverővei történő keverés, stb. alkalmazható. Célszerűnek találtuk a mechanikai keverés néhány másodpercig történő alkalmazását. Míg a szuszpendálás módja nem kritikus, lényeges, hogy bármilyen módon állítjuk is elő a szuszpenziót, a sejtek ne törjenek össze, mivel ekkor nemkívánt anyag kerül a vizes fázisba. A sejtszéttörést arról lehet felismerni, hogy a centrifugálásnál két rétegből álló szemcsét kapunk: a felső piros, míg az alsó fehér. A szuszpendált anyagot ezután centrifugáljuk. Bár a centrifugálás módja nem kritikus, az első centrifugálásnál ismertetett körülményeket itt is lelőnyöseknek találtuk. Centrifugálás helyett szűrés is alkalmazható. A feloldott szálak centrifugálásnál a szemcse feletti folyadékban, szűrésnél a szűrletben találhatók, amelyből a pH-érték csökkentésével csaphatok ki. A pH-érték csökkentésének mértéke természetesen függ attól, hogy Ti vagy T2 típusú szálakat állítunk-e elő. A leválasztás úgy is elérhető, hogy valamely ásványi sav, példáid kénsav ammóniumsóját adjuk hozzá, célszerűen vizes oldat formájában. Olyan mennyiségű ammóniumszulfátot használunk, hogy koncentrációja a telített oldat 4-10%-ának feleljen meg. A hozam és a tisztaság növelésére azonban kívánatosnak találtuk közbenső műveletek beiktatását az eljárásba a leválasztást megelőzően. Ezeknek a pótlólagos, hozamuövelő és tisztító lépéseknek megfelelően, a magas pH-értékű mosás után mind az oldatot, mind pedig a szemcsét félretesszük. A szemcsét ezután újra felszuszpendáljuk, célszerűen ugyanolyan vizes közegben, azonos pH-értéken és ugyanolyan módon, majd a szuszpenziót ismét hasonló módon centrifugájuk. A centrifugálás után a szemcsét elöntjük, s a két magas pH-értékű mosás utáni centrifugálásnál kapott oldatokat egyesítjük és ismét centrifugáljuk. Az ismételt centrifugálás célja a visszamaradó lebegő szennyeződések eltávolítása. A centrifugálást ezért a korábbiaknál nagyobb sebességgel hajtjuk végre. 12 KG és 70 KG közötti intenzitást alkalmazunk, s a centrifugálás ideje 30-60 perc. Általában célszerű 27—40 kg intenzitással pörgetni a szuszpenziót körülbelül 60 percig. A szemcséket ezután elöntjük, az oldatot pedig félretesszük. A találmány szerinti eljárásnak ebben a szakaszában rendszerint célszerű a GC szálak oldatának sterilizálása. Bizonyos esetekben ezt megkövetelik az Amerikai Egyesült Államokban érvényes előírások is. A sterilizálás könnyen végrehajtható olyan módon, hogy a GC szál oldatát, közvetlenül a kicsapás előtt, mikropórusú szűrőn vezetjük át. Különösen előnyösnek találtuk erre a célra a 0,45 mikron pórusméretű szűrőt. Ezután az anyagokat természetesen aszeptikus körülmények között kell kezelni, ha meg kívánjuk őrizni a sterilitást. Bizonyos körülmények között kívánatos lehet hogy a GC szálakat különálló pálcikák alakjában különítsük el, a kristályos alak helyett. Ebben az esetben a centrifugálással kapott tiszta oldatot ultracentrifugába vezetjük, és 60-166 KG közötti, előnyösen 106 KG intenzitással centrifugáljuk 2—4 órán át. Ekkor a kapott szemcsék különálló pálcikák alakjában tartalmazzák a szálakat. A szálakat úgy csapjuk ki ismét, hogy az oldat pH-értékét 9,1 alá csökkentjük. Azt tapasztaltuk, hogy a legjobb eredményeket, a kristályos anyag természetétől függően, megfelelő alacsony pH-jú pufferoldattal szembeni dialízissel kapjuk. Célszerűnek találtuk olyan pufferoldat alkalmazását, amelynek a kezdeti pH-értéke 8,3-8,6 között van, a T2 szálak esetén, míg a puffer vegyi összetétele nem kritikus. A dialízishez célszerűen 30-60-szoros felesleget, előnyösen 40-szeres felesleget alkalmazunk. A dialízis során a külső dializáló közeget 12—18 órán át kevertetjük mágneses keverő segítségével. Előnyösen a dialízist alacsony hőmérsékleten, azaz 0-10 °C között hajtjuk végre. Ez a hőmérséklettartomány csökkenti a nemkívánt bakteriális szennyeződés bekövetkezését. Megjegyzendő továbbá, hogy a pufferoldat pH-értéke függ a hőmérséklettől. Ezért, ha a puffer hőmérsékletét akkor mérjük meg, amikor a rendszert már lehűtöttük a működési hőmérsékletére. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
