174887. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gonococcus szálak előállítására
15 174887 16 azt tapasztalhatjuk, hogy a pH-érték akár 9,1-re emelkedett. Azonban ilyenkor is még kielégítő eredményeket kapunk. Megjegyzendő továbbá, hogy általában nincs szükség a puffer megváltoztatására, ha feleslegben vett puffert alkalmazunk a jelzett tartományban. A kristályszuszpenziót ekkor a GC szál kristályok elkülönítése céljából dolgozzuk fel. A legelőnyösebb, ha az elkülönítést közepes sebességű centrifugálással végezzük. Alkalmasnak találtuk a 3-8 KG intenzitással 60 percig végzett centrifugálást. A folyadék tisztáját ezután elöntjük. Ha a GC szál kristályokat tovább akarjuk tisztítani, kétszer vagy háromszor is megismételhetjük a feloldásból, nagy sebességű centrifugálásból, dialízisből és ismételt centrifugálásból álló ciklust. Ha a GC szál kristályokat nem használjuk fel azonnal, a szűréssel végrehajtott sterilizálás ellenére célszerű tartósítószer hozzáadása. A tartósítószert előnyösen nem magukhoz a szál kristályokhoz vagy az azokat tartalmazó oldathoz adjuk hozzá, hanem inkább az oldat pH-értékének csökkentésére alkalmazott dialízis-pufferhez. Abban az esetben, ha a hozzáadott tartósítószer nem összeférhető a pufferrel, akkor a szál kristályok kristályosítása után a puffert dialízissel eltávolíthatjuk, és egy új, összeférhető pufferre cserélhetjük ki, majd egy további dialízist végzünk, amelynél a tartósítószert és az új puffert alkalmazzuk. Tartósítószerként példáid formaldehidet, mertiolátot [(o-karboxi-fenütio)-etil-higany)] és nátrium azidot használhatunk, 0,02-0,05% közötti mennyiségben. Mindegyik említett tartósítószernek vannak bizonyos hátrányos hatásai. A formaldehid keresztkötéseket hoz létre a GC szál pálcikák között. Ennek következtében azok nem oldhatók fel ismét, mint korábban. A mertiolátnak nincs térhálósító hatása, és a kristályok ismét kialakulhatnak, az így kialakított kristályok azonban kevésbé képesek agglutinációra antitestek jelenlétében. Ennek ellenére, az antigénképesség nem szenvedett kárt. Ez azt jelenti, hogy a kísérleti alanyokba történő befecskendezéskor láthatóan normális antitesteket hoznak létre. A nátrium azid igen előnyös tartósítószer olyan tekintetben, hogy sem a kristályszerkezetet, sem az antigénképességet, sem pedig az agglutinációt nem befolyásolja. Sajnálatos módon azonban toxikus, és nem alkalmazható abban az esetben, ha a GC szál kristályokat emberekbe kívánjuk befecskendezni. A kristály készítményt célszerűen alacsony hőmérsékleten, azaz 1—4 C-on tároljuk. Ha hosszú ideig tartó tárolásra számíthatunk, a kristályokat célszerűen feloldjuk magas pH-értékű pufferoldatban, mikropórusú szűrőn keresztül szűrjük, és oldatban tároljuk steril körülmények között. Ha a GC szálakra kristályos alakban van szükségünk, célszerűen ismét kialakítjuk azokat a pH-értéknek a megfelelő kristályosítási értékre történő csökkentésével, attól függően, hogy T, vagy T2 szálakról van-e szó. Mind a sterilizálás, mind pedig a tartósítószer hozzáadása alkalmazható, ha a lehető legjobb tartósítást kívánjuk elérni. GC szálak tisztítása állandó pH-értéken történő feloldással A GC szálak állandó pH-értéken történő tisztításának módszere lényegében hasonló a fentebb ismertetett eljáráshoz, ahol eltérő pH-értékeket alkalmaztunk. Szolubüizáló szerként vizes oldatok alkalmazhatók, amelyek például sókat, célszerűen alkálifémek és alkáli földfémek ásványi savakkal képezett sóit tartalmazzák 0,5 feletti, célszerűen 4,0-5,0 közötti, előnyösen 4,4 körüli ionerősség mellett, karbamidot 3-5 M közötti koncentrációban, szacharózt 50súly% koncentráció felett, végül maga a víz is lehet szolubüizáló szer, ha az oldat ionerősségét 0,002 M alá csökkentjük. A találmány szerinti eljárás egyik változata szerint, ahelyett, hogy az első centrifugádnál kapott szemcsét, amely sejteket, szálakat és törmeléket tartalmaz, magas pH-értékű közegben szuszpendálnánk, valamelyik fentebb említett szolubüizáló szert alkalmazzuk az említett körülmények között. A szuszpenziót ezután kis sebességgel centrifugáljuk. Ha nagyobb termelést kivánunk elérni, a kis sebességű centrifugádnál kapott folyadék tisztáját félretesszük, a szemcséket ismét hasonló közegben szuszpendáljuk, újból centrifugáljuk és az így kapott folyadék tisztáját egyesítjük a korábbival, és nagy sebességgel centrifugáljuk. A nagy sebességű centrifugád sál kapott szemcséket elöntjük, a folyadék tisztáját pedig dializáljuk megfelelő puffer alkalmazásával a szolvatáló közeg eltávolítása céljából. így, ha a szolvatáló közeg nagy koncentrációjú só vagy szacharóz, az ionerősséget 0,5 alatti értékre csökkentjük a sónál, ületve 40% alatti értékre a szacharóznál. Karbamid esetén a karbamidot megfelelő puffer, előnyösen trisz puffert tartalmazó fiziológiás sóoldat alkalmazásával dializáljuk, hogy az ionerősség 0,05-0,3 között legyen 7,0 vagy 8,3 pH-értéken, attól függően, hogy Ti vagy T2 szálak kinyeréséről van-e szó. Hasonló módon, ha a szolvatáló szer víz, ugyanígy járunk el, hogy az ionerősséget legalább 0,05-re növeljük. Erre a célra ugyanolyan pufferoldatokat és ugyanolyan módon alkalmazhatunk, mint a találmány szerinti pH-változtatásos tisztítási módszernél. A GC szálak tisztítása sűrűségi grádiens létrehozásával végzett centrifugálással Az eljárás során a GC szálak és vizes céziumklorid-oldat elegyét együttesen centrifugáljuk, és az optikai sűrűség segítségével jelezzük egy adott huUámhosszon a centrifugacsőnek a szálakat tartalmazó részét. Jóüehet a centrifugálást pH = 9 alatti pH-értéken is végezhetjük, kedvezőbb eredményeket kapunk, ha 10,0—10,4 közötti pH-értéken, előnyösen 10,1-nél dolgozunk. Ennél a találmány szerinti eljárásváltozatnál a sejtszerű anyagokat, a szálakat és a törmeléket taiialmazó nyers szemcsét nagy pH-értékű pufferoldatban szuszpendáljuk, akárcsak a fentebb ismertetett eljárásváltozatnál, és megfelelő mennyiségű céziumkloridot adunk hozzá. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
