174887. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gonococcus szálak előállítására
174887 12 iával vagy vákuumos szívókészülékkel eltávolítjuk. Kívánt esetben egy második mosást is végezhetünk ugyanilyen módon, és a második szuszpenziót az elsővel egyesítjük. A hozam növelése érdekében egy harmadik mosást is végezhetünk magas pH-értékű pufferoldattal, azaz olyan pufferoldattal, amelynek a pH-értéke 9,3 felett, előnyösen 10,0-10,3 között van. A pufferoldat hatására feloldódik az összes visszamaradt szál anyag. Ha a T! szálak elkülönítése a cél, a pH értéke éppen csak 8,6 felett legyen, jóllehet hátrány nem származik a magasabb pH-érték alkalmazásából. Ezt a bázikus szuszpenziót nem egyesítjük az előző mosófolyadékokkal, hanem félretesszük a tisztítás egy későbbi szakasza számára. Megjegyzendő, hogy a jó száltenyészet jellegzetes narancs/piros vagy meleg piros színű, a táptalaj szaga pedig főtt ételre emlékeztet. A tenyészet tapadós, síkos aggregátumokká áll össze és könynyen lecsúsztatható a tápközegről megfelelő segédeszközzel, például üvegbottal. A fentebb említett műveletek kívánatosak olyan esetekben, amikor jó kitermelés a cél a nagy tisztaságú GC szálakból, lényegesen leegyszerűsített eljárással is elfogadható eredményeket kaphatunk. A találmány szerinti leegyszerűsített eljárásnál nem alkalmazzuk az előzőekben ismertetett első és második mosó műveletet. Az egész tenyészetet eléggé magas pH-értékű pufferoldattal, célszerűen etanolamin pufferoldattal kezeljük a harmadik mosás körülményei között. A mosóközeg, a feloldott GC szálakon kívül sok, egyébként eltávolított szennyező anyagot is tartalmaz. Azt tapasztaltuk azonban, hogy ezek a szennyező anyagok oldatban tarthatók a GC szálak anyagának lecsapása folyamán is, a későbbiek során ismertetésre kerülő módon. A Neisseria gonorrhoeae organizmusok süllyesztett tenyészete A Ti és T2 típusú organizmusok süllyesztett tenyészetét cseppfolyós közegben önmagában ismert módon állítjuk elő. Ugyanolyan táptalajt és körülményeket alkalmazunk, mint a felületi tenyészetnél, azzal az eltéréssel, hogy a táptalaj nem tartalmaz agar-agart kocsonyásító anyagként. Azt tapasztaltaltuk, hogy az organizmusok folyamatosan növekednek és termelik a szálakat. A süllyesztett táptalaj ennek következtében sok szuszpendált GC szál anyagot tartalmaz. Ha T2 típusú tenyészeteknél a pH értéke 9,3 alatt van, a szálak nem kívánt oldódása nem lép fel. A Tt organizmusok tenyészetében a pH-érték 7,7 fölé növekedhet, ezért a feldolgozást megelőzően az 5,5—7,7 közötti tartományban kell beállítani, előnyösen 7,0—7,2 közé. Jóllehet nem kritikus, azonban célszerű a pH-beállítást néhány órával, például 8-20 órával a feldolgozás előtt elvégezni, hogy ilyen módon biztosítsuk a részben feloldódott T, szálak kristályosodását. Mind a Tt, mind pedig a T? tenyészeteknél előnyös, bár semmiképpen nem elengedhetetlen, ha a tenyésztést a táptalaj enyhe keverése közben, kis 11 mennyiségű diatomaföld például celit jelenlétében végezzük. A celit mennyisége célszerűen 0,1—0,5% között legyen, előnyösen 0,3% a táptalaj súlyára vonatkoztatva. A GC szálak tisztítása A GC szál kristályok elválasztása a táptalajtól Megjegyzendő, hogy a Neisseria gonorrhoeae organizmusok felületi tenyésztésnél kapott mosófolyadék tartalmaz olyan, benne oldódó anyagot, amelynek nincs szerepe a GC szál kristályok elkülönítésénél. Hasonlóan, ugyanez igaz a süllyesztett tenyészeteknél is. A felületi tenyészet mosófolyadéka esetén (csupán az első két mosófolyadékról van szó) a folyadék mennyisége viszonylag csekély a tenyészet mennyiségéhez képest. Célszerűen az egész mosófolyadékot (amely tulajdonképpen szuszpenzió) viszonylag kis sebességgel centrifugáljuk. A centrifugálás sebessége és ideje semmiképpen nem kritikus. Előnyösnek találtuk, ha a pörgetést 1000 G és 12000 G (a továbbiakban 1 KG és 12 KG) közötti intenzitással végezzük, 5-30 percig. Különösen előnyös a 3 KG körüli intenzitás 10—15 percig történő alkalmazása. A centrifugáláskor kapott szilárd szemcse mind sejtszerű, mind pedig szál anyagot tartalmaz, a felette elhelyezkedő folyadékot pedig elöntjük. Ez a folyadék jelentős mennyiségű szennyező anyagot tartalmaz, valamint kis mennyiségben szálakat, amelyeket azonban nem érdemes visszanyerni. Süllyesztett tenyészet alkalmazása esetén a folyadéktérfogat eléggé jelentős, és ezért a centrifugálás kissé hosszadalmas lehet. Mély táptalajoknál a tenyészet elkülönítésére előnyösnek bizonyult a diatontaföldet tartalmazó „szendvics-szűrő” alkalmazása. Ennél a megoldásnál igen durva pórusú szűrőpapírt helyezünk az üvegszűrőre vagy a Büchner-tölcsérbe, a szűrőpapíron 2-5 mm vastagságban diatómaföld-réteget, célszerűen celitréteget alakítunk ki, és lefedjük egy másik durva pórusú szűrőpapírral. A tényleges szűrőközeg a celit, míg a felső szűrőpapír csupán a felület védelmére szolgál. Miután ellenőriztük a tenyészet pH-értékét, annak biztosítására, hogy a szálak kristályos formában legyenek jelen, a tenyészetet szűrjük, a szűrletet pedig elöntjük. Az egyesített maradékokat ezután felvesszük magas pH-értékű pufferoldatban, amely hasonló a felületi tenyészeteknél a harmadik mosásnál alkalmazotthoz, és a szuszpenziót centrifugáljuk 1-12 KG közötti intenzitással. Ebben az esetben természetesen a centrifugálás utáni szemcse a diatomaföld hordozót és a sejttörmelékeket tartalmazza a GC szál anyag pedig a folyadékban helyezkedik el. Ennél a fázisnál a GC szál anyagot célszerűen elválasztjuk a sejttörmelékektől, süllyesztett tenyészet esetén pedig a diatómaföldtől is. A felületi tenyészet alacsony pH-értékű mosófolyadékának centrifugálásával kapott szemcse esetén ezt olyan módon hajthatjuk végre, hogy vizes közeget adunk hozzá, amely felhasítja a GC szál pálcikák közötti nem-kovalens kötéseket, ugyanakkor érintetlenül hagyja a kovalens kötéseket. Ezáltal a GC szál kristályok feloldódnak, és 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
