174883. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antigén kinyerésére és az antigént tartalmazó reagenskészítmény előállítására
5 174883 6 az antigént a sejtekből olyan, lúgosra pufferolt vizes alkálifémsó-oldattal extraháljuk, amelynek pH-ja mintegy 6,0 és mintegy 11,0 közötti és amelyben s só koncentrációja legalább 0,01 mól, ezután adott esetben a koncentrált antigént savas kicsapásnak vetjük alá olyan vizes savoldattal vagy savas pufferoldattal, amelynek pH-ja mintegy 1,0 és mintegy 6,0 közötti és amelyben a sav vagy a puffer koncentrációja legalább mintegy 0,01 mól, ezt követően a savas kicsapásnak alávetett antigént szolubilizáljuk olyan vizes, lúgos kémhatású pufferoldattal, amelynek pH-ja mintegy 6,0 és mintegy 11,0 közötti és amelyben a puffer koncentrációja legalább mintegy 0,01 mól, majd a szolubilizált antigént lebontásnak vetjük alá egy proteinázzal mintegy 0,25 óra és mintegy 4 óra közötti időn át mintegy 0 °C és mintegy 45 °C közötti hőmérsékleten, s végül az antigén enzimes lebontását önmagában ismert módon megszakítjuk. A sejtek célszerűen formaldehiddel végzett konzerválásakor azt találtuk, hogy az antigén nagyon stabillá válik, 4°C-on tárolható és megnövelt időperióduson át teljesen aktív marad. A találmány gyakorlati megvalósítása során Neisseria gonorrhoeae törzset levegőztetett folyékony táptalajon mintegy 4—72 órán át tenyésztünk, majd a sejteket konzerválószerrel elöljük. Előnyös konzerválószer a formalin. Más alkalmas konzerválószerek közé tartozik bármely olyan szer, amely elterjedt sejtek vagy szövetek hisztológiai és/vagy mikroszkópos vizsgálat céljából végzett konzerválására. A Neisseria gonorrhoeae elölt sejtjeit ezután elválasztjuk a táptalajtól centrifugálás, szűrés, dekantálás vagy más módszer alkalmazása útján, és a táptalajt félretesszük. Az elkülönítés előnyös módja a centrifugálás útján való pelletezés. Az elölt és konzervált sejtekből az antigén extrahálás olyan lúgosra pufferolt, sóoldattal hajtjuk végre, amelynek koncentrációja mind a puffer, mind a só vonatkozásában legalább 0,01 mólos, vagy ennél nagyobb, előnyösen a lúgos kémhatású pufferre 0,1 mólos és a sóra nézve 1,0 mólos. Előnyösen alkalmazható lúgos puffer a nátrium-foszfát, de használhatunk más alkalmas puffereket, például trisz-(hidroximetil)-aminometánt, N-2-hidroximetilpiperazin-N-2-etánszulfonsavat vagy bórátokat. Sóként előnyösen kálium-kloridot használunk, de alkalmasnak találtunk más, káliumot, nátriumot vagy lítiumot tartalmazó sókat is. A lúgosra pufferolt sóoldat pH-ját mintegy 6,0 és mintegy 11,0, optimálisan mintegy 8,2 és 8,8 különösen előnyösen 8,2 és 8,5 közé állítjuk be. Az antigén extrahálása után a sejteket elválasztjuk az extraktumtól, majd az utóbbit koncentráljuk, például ultraszűrés, szárítás és/vagy dialízis útján. A koncentrált extraktumot ezután vizes savval vagy savas pufferoldattal kezeljük az antigén kicsapása céljából. Az antigén kicsapható olyan vizes savval, mint az 1 n sósavoldat vagy pedig egy olyan vizes pufferoldattal, amelynek pH-ja mintegy 1,0 és mintegy 6,0, optimálisan mintegy 2,0 és 4,0 közötti, különösen előnyösen mintegy 3,6. A savas puffer koncentrációja mintegy 0,01 mól és mintegy 1.0 mól közötti lehet, optimálisan mintegy 0,1 mól. Alkalmas savas pufferként megemlíthetjük például az acetát-, Mcüvanine-féle vagy a barbitol-acetát-puffert. A savas kicsapásnak alávetett antigént a savtól vagy a savas puffertól ezután például centrifugálással elválasztjuk, majd savval vagy savas pufferoldattal egyszer vagy többször mossuk, ezt követően pedig olyan vizes, lúgos kémhatású pufferoldattal szolubilizáljuk, amelynek pH-ja mintegy 6.0 és mintegy 11,0, optimálisan 8,2 és 8,8, különösen előnyösen 8,2 és 8,5 közötti. E pufferoldat koncentrációja mintegy 0,01 mól és mintegy 1.0 mól optimálisan mintegy 0,05 mól és mintegy 0,1 mól közötti lehet. Hasonlóan az extrakciós művelethez, lúgos kémhatású pufferként például nátrium- vagy kálium-foszfátot, trisz-(hidroximetil)- a minometánt, N-2-hidroximetilpiperazin-N-2-etánszulfonsavat vagy bórátokat használhatunk. Előnyös puffernek tartjuk a sósav és a trisz-(hidroximetil)-aminometán keverékét, például a 8,2—8,5 pH-jú 0,05 mólos trisz-(hidroximetil)-aminometán-hidroklorid puffert. Az antigén enzimes lebontását a proteinázokkal, például pepszinnel, tripszinnel, kimotripszinnel, papainnal vagy kimopapainnal hajthatjuk végre. Előnyös enzim a pepszin. Az enzim koncentrációjának felső határát illetően nincs más érték, mint a gyakorlat diktálta. Az enzim koncentrációjának alsó határa az antigénnek 280 nm-nél mért egy optikai sűrűség egységére vonatkoztatva mintegy 0,01 mól. Miként említettük, az enzimes lebontást mintegy 0,25 óra és mintegy 4 óra közötti időn át mintegy 0 °C és mintegy 45 °C közötti hőmérsékleten hajtjuk végre. A pepszin esetében az előnyös idő és hőmérséklet mintegy 1,25 óra, illetve mintegy 37 °C. A lúggal szolubilizált antigén pH-ját kívánt esetben és/vagy szükséges esetben a lebontáshoz konkrétan használt enzim figyelembe'-ételével megfelelően beállítjuk. így például ha pepszinnel dolgozunk, akkor a szolubilizált antigént savas pH-ra, azaz mintegy 1,0 és mintegy 6,0 közötti, előnyösen 3,2 körüli pH-ra állítjuk be. A lebontás leállítása céljából a pepszin pH-ját lúgosra, azaz mintegy 6,0 és mintegy 11,0 közötti, közelebbről 8,2—8,8 pH-ra állítjuk be. Más enzimek esetében a lebontás leállítását enzimméreg, például higany és cianidok adagolása útján idézzük elő, ha a pH változtatása nem megfelelő intézkedés. Miként említettük, Neisseria gonorrhoeae antigén elkülöníthető abból a folyékony táptalajból is, amelyben Neisseria gonorrhoeae sejtek növekedtek. E célból úgy járunk el, hogy a sejteket a táptalajtól elválasztjuk, majd a táptalajt koncentráljuk. Az így kapott nyers antigén közvetlenül felhasználható a találmány szerinti antigén-reagenskészítmény előállításában. Előnyösen azonban a nyers antigént továbbfeldolgozzuk, éspedig a táptalajból az antigént olyan vizes savoldattal vagy savas pufferoldattal kicsapjuk, amelynek a pH-ja mintegy 1,0 és mintegy 6,0 közötti és amelyben a sav vagy a puffer koncentrációja legalább 0,01 mól, ezután a kicsapott antigént olyan vizes, lúgos kémhatású pufferoldattal szolubilizáljuk, amelynek pH-ja mintegy 6,0 és mintegy 11,0 közötti és amelyben a 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
