174883. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antigén kinyerésére és az antigént tartalmazó reagenskészítmény előállítására
3 174883 4 A találmány szerinti eljárás gyakorlati megvalósítása során tehát például folyékony táptalajon növekedett Neisseria gonorrhoeae sejtekből vagy pedig magából a folyékony táptalajból antigént különítünk el oldat formájában, és ebből az oldatból az antigént azután koleszterin-lecitin részecskékhez kapcsoljuk. Ezek a részecskék az antigénnek Neisseria gonorrhoeae antitesteket tartalmazó szérum jelenlétében való agglutinálójához szolgálnak hordozóként. Az antigén-koleszterin-lecitin komplex agglutinációjának láthatóságát úgy növeljük, hogy a komplexet zsíroldható festékkel megfestjük. Így a találmány egyik gyakorlati alkalmazási területe egy olyan makroszkopikus vizsgálat, amely emberi vérszérummal végezhető el a gonorrhoea kórokozójaként ismert Neisseria gonorrhoeaehoz rendelhető antitestek kimutatása céljából. Az ilyen antitestek ugyanis jelzik a gonorrhoea megbetegedés meglétét, illetve a múltban bekövetkezett megbetegedést. E célból vénás vérből vett melegített vérszérumban kell a vizsgálatot végrehajtani, amely jelzi, hogy a vizsgált személyek közül kik szenvednek gonorrhoea megbetegedésben és kik a betegség hordozói. Melegvérűekkel folytatott vizsgálatok során bebizonyosodott, hogy Neisseria gonorrhoeae sejtekből és az ezen sejtek növekedésére szolgáló táptalajból elkülönített antigén is intenzív antitest-reakciót vált ki melegvérű állatokban, továbbá a gonorrhoea ellen ez az antigén felhasználható immunizáló ágensként. } A találmány tárgya tehát eljárás Neisseria gonorrhoeae antigén, mégpedig membránhoz asszociálódott és/vagy felületi antigén elkülönítésére Neisseria gonorrhoeae sejtjeiből vagy pedig azon folyékony, félszilárd vagy szilárd táptalajból, amelyen ezek a sejtek növekedtek. A találmány tárgya továbbá eljárás az antigén-reagenskészítmény előállítására, amely fertőzés vagy megbetegedés kimutatására alkalmas a találmány szerint elkülönített antigént egy festékanyaggal és kolcszterin-lecitin részecskékkel kombináltan hasznosítva. A leírásban ismertetünk továbbá eljárást ilyen antigén-reagenskészítményt tartalmazó vizsgálókészlet előállítására, valamint fertőzések kimutatására alkalmas agglutinációs módszert, utóbbihoz szintén a találmány szerint antigén-reagenskészítményt hasznosítjuk. Ismertetjük e módszernek teszt kártyával végzett változatát. A leírásban az antigént hordozó sejtek folyékony táptalajon végzett tenyésztését, ilietve növekedését, valamint az antigének a komplett sejtekből, illetve e folyékony táptalajból való elkülönítését ismertetjük. Szakember számára nyilvánvaló azonban, hogy a találmány szerinti eljárás alkalmazható az esetben is, ha az antigént hordozó sejtek féligszilárd vagy szilárd hordozón, például zselatinon, agaron, agarózon vagy ezek keverékén növekednek, majd az antigén elkülönítése, közelebbről extrahálása a komplett sejtekből, valamint a féligszilárd hordozóból történik. Ebben az esetben a sejteket lekaparjuk a táptalajról, például agárról, majd az agart elfolyósítjuk például egy keverővei, ezután pedig az antigént extraháljuk a találmány értelmében mind a sejtekből, mind az elfolyósított agárból. A találmány szerint lehetővé válik a membránhoz kötött és/vagy felületi antigén szolubilizálása, ugyanakkor a sejt szerkezeti egysége is fennmarad a citoplazmikus komponensek minimális kiszivárgása mellett. A nyers formában (azaz savas kicsapás és enzimes lebontás nélkül) kapott antigén vagy pedig a savas kicsapás és enzimes lebontás útján továbbfeldolgozott antigén ezután koleszterin-lecitin részecskékre adszorbeáltatható, amikoris a találmány szerinti diagnosztikai antigén-reagenskészítményt kapjuk. A találmány szerinti antigén-reagenskészítmény előállításában hasznosítható antigén lehet a sejtekből elkülönített, savas kicsapásnak és enzimes lebontásnak alá nem vetett nyers antigén, a sejtekből elkülönített, savas kicsapásnak és enzimes lebontásnak már alávetett antigén, a táptalajból elkülönített, savas kicsapásnak és enzimes lebontásnak alá nem vetett antigén, valamint a táptalajból elkülönített, savas kicsapásnak és enzimes lebontásnak alávetett antigén, illetve ezen antigének különböző keveréke. A találmány szerinti eljárással elkülönített antigének kísérleteinek során mind in vitro, mind in vivo aktivitást mutattak. A találmány értelmében elkülönített antigén in vivo és in vitro aktivitására példaként az alábbiakban részletesen ismertetett, Neisseria gonorrhoeae baktériummal végrehajtott tesztet említjük. Melegvérű állatokkal végzett kísérleteink eredményei ugyanakkor azt igazolták, hogy a találmány értelmében elkülönített antigén melegvérű állatokban antitestreakciót vált ki. Enzimes lebontásnak alávetett Neisseria gonorrhoeae antigént egerekbe és patkányokba oltottunk Freund-féle inkomplett segédanyaggal kombinációban. Mind az egerek, mind a patkányok szerológiai választ adtak olyan antitesteket termelve, amelyek erőteljesen agglutinálták a koleszterin-lecitin részecskékhez kapcsolt antigént. Ez a kísérlet azt jelzi, hogy enzimes lebontásnak alávetett Neisseria gonorrhoeae antigén felhasználható lenne bőrteszt-antigénként emberi gonorrhoea diagnosztizálására. Az antigént az e célra kívánt aktivitási szintre lenne szükséges beállítani, majd olyan merítő kompozícióba lenne szükséges bedolgozni, amelynek összetétele hasonló a tuberkulózis diagnosztizálására alkalmazott karcolásos tűs kísérletben használt kompozícióéhoz. A tűket azután ebbe a merítő kompozícióba merítenénk, amikoris a tűhegyre a bőrreakció kiváltásához szükséges mennyiségű kompozíció tapadna. Ha az így kezelt tűvel megérintenénk vagy átszúmánk a bőr felületét, akkor a bőrszövet az antigén egy részét visszatartaná. Ha az antigénre van immun sejtreakció, akkor egy kiütés és erithema válna láthatóvá, hasonlóan más bőrteszt-antigénekhez. Alternatív módon az antigén intradermálisan lenne beadható és hasonló típusú reakciót váltana ki. A találmány értelmében tehát Neisseria gonorrhoeae antigén úgy különíthető el folyékony táptalajon növekedett sejtekből, hogy Neisseria gonorrhoeae komplett sejteket elölünk és konzerválunk, ezután a sejteket a folyékony táptalajból elkülönítjük, majd 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
