174782. lajstromszámú szabadalom • Eljárás restrikciós endonukleáz előállítására bacillus sphaericusból
174782 A találmány szerinti eljárás egy előnyös foganatosítási módja szerint fehéije-hidrolizátumként triptont vagy kazein-hidrolizátumot használunk. A fermentálást 22 °C és 32 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 30—32 °C-on célszerű lefolytatni. Az enzimet tartalmazó sejteket a fermentlétől centrifugálással célszerű elkülöníteni. A sejtek feltárását előnyösen ultrahangos kezeléssel végezhetjük. A feltárás után kapott fehéijeoldatból gélszűréssel, ammóniumszulfátos kicsapással és foszfocellulózon végzett kromatografálással kaphatjuk meg az egyéb nukleáz-szennyezéstől mentes restrikciós endonukleázt. A tenyésztést 22—37 °C-on, előnyösen 30 °C-on végeztük síkrázógépben vagy fermentorban, és a növekedést az optikai denzitás mérésével követtük. Amikor a tenyészet elérte a késő logaritmikus fázist (OD550 = 1200e lombikban, illetve 2500 fermentorban), a tenyészetet lehűtöttük, majd 0 °C-on 30 percen át 10000 g-vel centrifugáltuk. A centrifugálással kapott sejtmassza közvetlenül felhasználható az enzim előállítására, de —20 °C-on több hónapig is raktározható anélkül, hogy az enzim aktivitásában csökkenés következne be. Az enzimtisztítást úgy végeztük, hogy 10 g nedvessúlyú sejtet 20 ml 20 mM-os, pH 8-as, 14 mM 2-merkaptoetanolt és 0,1 mM EDTA-t tartalmazó TrisHCl pufferben felszuszpendáltunk. A sejtfeltárást MSE ultrahangos sejtfeltáróban végeztük (a készülék típusa: MSE ULTRASONIC Power Unit 100 W; gyártó cég: Measuring Scientific Equipment Ltd., Manor Royal, Crawley, Sussex, Nagy-Britannia). A hűtést só—jég hűtőkeverékkel és a szonikálás 30 másodpercenkénti megszakításával biztosítottuk. Az ultrahangos kezelést addig folytattuk, míg a szuszpenzió 550nm-en mért zavarossága az eredeti érték 15%-ára nem csökkent. A tisztítás valamennyi további lépését célszerű 4 *C-on végezni. A sejttörmeléket centrifugálással távolíthatjuk el. Erre kis fordulatszámú centrifugálás is megfelel, amivel csak a sejttörmeléket ülepítjük ki, de előnyösebb ultracentrifugálást alkalmazni (100 000 g, 90 perc), amivel a riboszómák is eltávolíthatók. A felülúszóból a DNS eltávolítására legalkalmasabb a gélszűrés. Ezt Whatman MS—PC 2500 típusú kromatografáló oszlopon (gyártó cég: Whatman, Springfield Mill, Maidstone, Kent, Nagy-Britannia) és perisztaltikus pumpa (LKB, Stockholm, Bromma 1, Svédország) felhasználásával végeztük, 10 ml/óra átfolyási sebesség alkalmazásával. A gélszűrés előtt a felülúszóhoz annyi nátrium-kloridot célszerű adni, hogy végkoncentrációja 1 M legyen, mert ilyen koncentráció mellett az enzim ledisszociál a DNS-ről. A gélszűrés után kapott egyesített aktív frakciókat ammóniumszulfátos frakcionálásnak vetettük alá. Azt tapasztaltuk, hogy 7,5-8 körüli pH-n a restrikciós endonukleáz 50%-os telítéssel már teljes mértékben kisózódik. Az üledéket célszerű híg foszfátpufferben feloldva végzett dializálással elkülöníteni az ammóniumszulfáttól. A dialízis alatt rendszerint kis mennyiségű csapadék jelenik meg, amely alacsony fordulatszámú centrifugálással eltávolítható. A kötődés elősegítésére előnyös az így dializált fehérje-oldatot néhányszorosára felhígítani híg foszfátpufferben (10 mM K-foszfát, 10 mM 2-merkaptoetanol, 0,1 mM EDTA, pH 7,5). 5 Az enzimkészítmény további tisztítására a foszfocellulózos kromatográfiát találtuk legmegfelelőbbnek. Ehhez Whatman MS—PC 1520 típusú oszlopot (Cat. No. 6990; gyártó cég: Whatman, Springfield Mill, Maidstone, Kent, Nagy-Britannia) és a fentebb említett perisztaltikus pumpát használtuk 6 ml/óra átfolyási sebesség mellett. Az oszlopot a fenti foszfátpufferrel ekvilibráltuk. Lényeges, hogy az enzimkészítményt lassú átfolyás mellett vigyük az oszlopra. Az oszlop eluálására a 0-tól 1 M-ig terjedő kálium-klorid gradienst találtuk legmegfelelőbbnek. Ebben az állapotban az enzim hetekig tárolható 4 °C-on lényeges aktivitás-veszteség nélkül, de előnyösebb 50% glicerint tartalmazó fenti foszfátpufferrel szemben dializálni, és ezután —20 °C-on tárolni. Ilyen módon tárolva hat hónap után sem tudunk aktivitásveszteséget kimutatni. A foszfocellulózról visszanyert enzimkészítmény — bár csak részlegesen tisztított — megfelel mindazoknak a kívánalmaknak, melyeket szerkezetelemzésre szánt restrikciós enzimkészítményekkel szemben támasztanak, azaz mentes minden egyéb natív DNS-re specifikus endo- vagy exonukleáztól. A foszfocellulózos frakciót SDS-gélen futtatva Coomassie Blue festéssel 10—15 fehérjecsíkot lehet kimutatni. A preparátum fajlagos aktivitása 25-30-szor nagyobb az ultracentrifugás felülúszóban mértnél. Azt, hogy a tisztított enzim nem tartalmaz szennyező endonukleázt, az bizonyítja, hogy az alább ismertetett módon lambda fág DNS-sel végzett aktivitás-meghatározás körülményei között többszázszoros enzimfelesleggel emésztve sem válnak a DNS-fragmenteket jelző csíkok elmosódottá. Szennyező exonukleázok jelenlétét az emésztés hatására keletkező savoldható radioaktivitás mérésével vizsgáltuk. Megállapítottuk, hogy 200-szoros enzimfölösleg hatására a reakcióelegyben levő lambda fág DNS radioaktivitásának kevesebb, mint 0,05%-a válik savoldhatóvá, azaz bomlik nukleotidokra, ami gyakorlatilag kizárja exonukleáz-aktivitás jelenlétét. Különleges célokra, pl. enzimológiai vizsgálatokhoz nagymértékben tisztított enzimpreparátumra lehet szükség. Ezt olyan módon állíthatjuk elő, hogy a foszfocellulózos preparátumot 10 mM Tris—HCl pH 7,5 0,1 M nátriumklorid összetételű pufferbe dializáljuk át, majd egyszálú DNS-t tartalmazó DNS-agaróz oszlopra visszük, és arról célszerűen nátrium-klorid gradienssel eluáljuk. A tisztítás során az enzimaktivitást két módszerrel határoztuk meg: az egyik a Smith-féle csapadékos vizsgálat (Methods in Molecular Biology; Wickner R.E. ed., Marcel Decker, Inc., New York, Vol. 7. p. 71—87), a másik egy titrálás [Roberts et al., J. Mol. Biol. 91, 121-3 (1975)]. Utóbbit lambda fág DNS emésztésével végezzük olyan módon, hogy meghatározzuk azt a legkisebb enzimmennyiséget, amely optimális körülmények között (25 mM TrisHCl pH 7,5 10 mM magnézium-klorid lOmM 2-merkaptoetanol, 50 mM NaCl, 37 °C) 60 perc alatt 1 fxg lambda DNS-t teljesen megemészt; ez az ún. lambda egység. Az enzim specificitását 0X174 bakteriofág DNS emésztésével határoztuk meg. Kettős emésztést végeztünk Bacillus subtilis-ból és Bacillus sphaericus-ból izolált restrikciós endonukleázzal az azonosság eldöntése céljából. Megállapítottuk, hogy a Bsp spécifiâtá-6 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
