174782. lajstromszámú szabadalom • Eljárás restrikciós endonukleáz előállítására bacillus sphaericusból
7 174782 8 sa azonos a Bsu és Hae III enzimekével, mely specificitását korábban szekvenciaanalízissel megállapították (5’ GGCC). A találmány szerinti eljárás főbb előnyei a következők: a) Az általunk izolált Bacillus sphaericus törzs sejtjeinek restrikciós endonukleáz-tartalma legalább ötvenszerese az eddig előállításra használt, azonos specifitású enzimet termelő sejtek enzimtartalmának. Az enzimtartalom meghatározását Roberts és társai fentebb ismertetett enzimaktivitás-mérő módszerével végeztük. b) A Bacillus spaericus R törzsben levő igen magas enzimtartalom mellett a Bsp szokatlanul nagy stabilitása a tisztítás során lehetővé teszi, hogy néhány egyszerű tisztítási eljárás kombinációjával a biokémiai gyakorlat számára megfelelő tisztaságú, sőt egy affinitáskromatográfiás lépés beiktatásával (kihasználva a Bsp egyszálú DNS-sel szemben mutatott igen nagy affinitását) homogén enzimpreparátumot állítsunk elő. Az enzim a foszfocellulózos kromatográfia elvégzéséig a tisztítás bármely lépésében aktivitás-veszteség nélkül tárolható egy héten át 4 °C hőmérsékleten. c) Különösen előnyössé teszi az eljárás alkalmazását az a tény, hogy a restrikciós enzim felhasználását zavaró aspecifikus nukleázok koncentrációja a B. sphaericus R törzsben szokatlanul alacsony, és azok a restrikciós endonukleáztól könnyen elválaszthatók. A törzs alacsony aspecifikus nukleáz-tartalmát jelzi, hogy egyrészt már a tisztítás kezdeti lépésében a centrifugálás vagy ultracentrifugálás után kapott enzimkészítmény elmosódásmentes gélképet ad, ha lambda fág DNS-t emésztünk 3—S-szörös feleslegben adott enzimmel, másrészt a szubsztrátumban levő radioaktivitásnak viszonylag kis (1%-nál kisebb) hányada válik hasonló körülmények között savoldhatóvá. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg. 1. példa A B. sphaericus R ferde agar tenyészetéről 5 db 3 literes Erlenmeyer-lombikban beoltottunk 1—1 liter alábbi összetételű táptalajt: 1 % tripton 0,5% élesztőkivonat 0,5% nátriumklorid A táptalaj pH-ja sterilezés előtt 7,2-7,4 volt. A táptalajt autoldávban sterileztük 121 °C-on 30 percig. A lombikot síkrázógépben (150 ford/perc) 25—35 °C hőmérsékleten rázattuk. Az optimális tenyésztési hőmérséklet 30 °C, melyen az említett körülmények között a kétszereződési idő 100 perc. A baktériumtenyészet növekedését az 550nm-en mért optikai sűrűség mérésével követtük. A késői logaritmikus fázist elért tenyészeteket jégfürdőben gyorsan lehűtöttük és lecentrifugáltuk (10 000 g, 30 perc). 10 g így kapott baktériummasszát felszuszpendáltunk 14 mM 2-merkaptoentanolt és 0,1 mM EDTA-t tartalmazó 20 ml pH 8-as 20 mM-os TrisHCl-ben, és a sejteket MSE ultrahangos sejtfeltáró készülékben feltártuk. Ultrahangozás közben a szuszpenziót só—jég keverékkel hűtöttük, és a szonikálást a túlmelegedés megelőzésére 30 másodpercenként megszakítottuk. 4 Az ultrahangos kezelést addig folytattuk (10 g sejtnél általában 7—8 perc összesen), míg a szuszpenzió 550nm-en mért optikai sűrűsége az eredeti érték 15—20%-ára nem csökkent. A szuszpenziót ezután ultracentrifugáltuk (100 000 g, 90 perc). A felülúszóhoz kristályos nátrium-kloridot adtunk 1 M végkoncentrációig, majd a feltárásnál alkalmazott, de 1 M nátrium-kloridot tartalmazó pufferrel ekvilibrált, 2,5X75 cm nagyságú BioGel AO, 5 m oszlopra (gyártja: Bio-rad Laboratories, Richmond, Amerikai Egyesült Államok) vittük. Az oszlop átfolyási sebessége 40 ml/perc volt. A frakcionálási térfogatban lejövő enzimtartalmú frakciókat egyesítettük, és ammóniumszulfáttal egy lépésben 50%-ig telítettük. Az ammóniumszulfát hozzáadása közben a pH-t tömény ammónium-hidroxid hozzáadásával 7,5 és 8 között tartottuk. Az ammóniumszulfátos csapadékot lecentrifugáltuk (20 000 g, 30 perc), majd az üledéket 10 ml PC pufferben (10 mM K-foszfát, pH 7,5, 10 mM 2-merkaptoetanol, 0,1 mM EDTA) feloldottuk, és ugyanezzel a pufferrel szemben dializáltuk. A dialízis során megjelent csapadékot centrifugálással (3000 g, 20 perc) eltávolítottuk. A dializált enzimtartalmú folyadékot PC pufferrel 5-szörösére hígítottuk, majd 2X14 cm nagyságú PC pufferrel ekvilibrált foszfocellulóz (Whatman Pl 1 ; gyártja: Whatman Springfield Mill, Maidston, Nagy- Britannia) oszlopra vittük 6 ml/perc átfolyási sebesség mellett. Ezután a1 oszlopot a kiindulási pufferrel mostuk, míg az átfolyó 280 nm-en mért extinkciója nullára nem csökkent, majd az oszlopot 250 ml térfogatú, 0-tól 1 M-ig folymatosan növekedő töménységű kálium-klorid oldattal eluáltuk. Az enzim 0,35 M és 0,5 M közötti sókoncentráció mellett eluálódott. Az így kapott enzimpreparátumot 50% glicerint tartalmazó PC pufferrel szemben dializáltuk, és —20°C-on tároltuk. Kitermelés: 50%-os (2 300 000 lambda egység 10 g sejtből). A készítmény fajlagos aktivitása: 150 000 lambda egység/mg protein. 2. példa A B.sphaericus R ferde agar tenyészetéről 1 liter alábbi összetételű táptalajt oltottunk be: 1 % kazeinhidrolizátum 0,5% élesztőkivonat 0,5% nátrium-foszfát 0,2% glükóz. A táptalaj pH-ja sterilezés előtt 6,9—7,3 volt. A táptalajt autoklávban, 121 °C-on 30 percig sterileztük. A glükózt külön sterileztük. A 12 órán át nőtt 1 liter tenyészettel New Brunswick Microferm fermentorban inokuláltunk 101 azonos összetételű táptalajt. A fermentálás kezdetén 3 ml Serva ,Antischaum” (gyártja: Serva Ag, Heidelberg, Német Szövetségi Köztársaság) habzásgátlót adtunk a tenyészethez. A fermentációs hőmérséklet 28—32 8C, optimálisan 30 *C volt. Az átáramoltatott levegő térfogata percenként 16 liter, a keverő fordulatszáma 400/perc volt. Fermentorban végzett tenyésztésnél a B. sphaericus R ODsso = 2,5-ös optikai sűrűségnél éri el a logaritmikus fázis végét. Ekkor a tenyészetet lombi-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
