174782. lajstromszámú szabadalom • Eljárás restrikciós endonukleáz előállítására bacillus sphaericusból
3 174782 4 Az említett 80 enzim csak 20 különböző specificitást jelent, ugyanis sok esetben rendszertanilag távol eső fajokból izolált enzimek is azonos szekvenciákat ismernek fel, vagyis izoszkizomerek. Amikor egy-egy biokémiai probléma megoldásához restrikciós enzimet választanak, ilyen enzimkészlet Baktérium Haemophilus aegyptius Bacillus subtilis X5 Haemophilus haemoglobinophilus Streptococcus faecalis Providentia alcalifaciens Az itt felsorolt ötféle enzim a találmány szerinti restrikciós endonukleázzal azonos specifitású, tehát ugyanolyan biokémiai feladatok megoldására lehet felhasználni, mint a Bsp-t. Ezek közül csak két enzim, mégpedig a Haemophilus aegyptius-ból izolált Hae III és a Bacillus subtilis-ből izolált Bsu terjedt el a biokémiai gyakorlatban. Ez a két enzim a találmány szerinti eljárással előállított Bsp-hez viszonyítva az alábbi főbb hátrányokkal rendelkezik: a) a Haemophüus aegyptius igen drága táptalajt [agy-sziv kivonatot (brain heart infusion)] igényel; b) a Bsu a tisztítás és raktározása alatt meglehetősen labilis, könnyen inaktiválódik; c) mindkét enzim csak rossz hozammal állítható elő. Az általunk levegőből izolált Bacillus sphaericus R törzs genetikai tulajdonságai arra utalnak, hogy a baktérium termel restrikciós endonukleázt. Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy a szokásos körülmények között végzett levegőztetett tenyészetek sejtjeiben a restrikciós endonukleáz-tartalom rendkívül magas volt, és annak izolálását az enzim stabilitása nagymértékben megkönnyítette. Az izolálási eljárás további egyszerűsítését tette lehetővé, hogy a restrikciós endonukleáz mellett található egyéb nukleáztartalom rendkívül alacsony, és ettől a specifikus enzim egyszerű eljárással elválasztható. A restrikciós endonukleáz termelésre izolált Bacillus sphaericus törzs azonosítását a Bergey Manual (6. kiadás, 1948) alapján végeztük. A baktérium jellemzői: Mikroszkópos morfológia: 0,6—1X4—6 p nagyságú pálcikák; többségükben egyenként, de egyesek rövid láncokat alkotnak. Közepes élénkséggel mozog. Csak a nagyon fiatal tenyészet festődik Gram-pozitívan, 2 mellett már gyakorlati szempontok is érvényesülnek, tehát az, hogy egy-egy izoszkizomer-csoportból melyik enzim állítható elő legkönnyebben, legolcsóbban és legnagyobb mennyiségben. Az izoszkizomer-cso- 5 port, amelybe a találmány szerinti eljárással előállított restrikciós endonukleáz is tartozik, a következő enzimekből áll: Enzim Az enzimet leíró irodalmi hely Hae III Middleton, J.H. et al.: J .Virol 10,42-50(1972) Bsu Bron, S. et al.: Molec and Gen. Genetics 143. 12-13(1975) Hhg Roberts, R.L. et al., személyes közlés Sfa Wu,R. et al., személyes közlés Pal Galinas, R.E. et al., személyes közlés. egyébként Gram-negatív. Spórák: gömb alakúak, 0,7-1,5 p átmérőjűek, terminális elhelyezkedésűek, a sporangium kidudorítja a sejtfalat. Kolóniák élesztőkivonatot és tripont tartalmazó 35 agarlemezen: kerek, fénylő, sima felületű, sárgásbarna áttetsző telepek. 30 °C-on 48 óra alatt nőnek 2-3 mm átmérőjűre, több napos inkubáció után matt felületűvé, kevésbé áttetszővé válnak, a telepek szélén gyűrű jelenik meg. 40 Folyadéktenyészet: tripon-tartalmú rázatott folyadékkultúrában élesztőkivonat egyenletes zavarosságot okoz. A baktérium fenntartható élesztőkivonat—tripton tartalmú ferde agaron, vagy raktározható —20 °C-on 45 50%-os glicerinben szuszpendálva. A baktériumot a szokásos módszerekkel, síkrázógépben, rázatott kultúrában vagy fementorban tenyésztettük komplex tápanyagforrásként élesztőkivonatot, fehéije-hidrolizátumot és szervetlen sót tartal- 50 mazó táptalajokon, melyek közül különösen magas enzimszintet lehetett elérni a következő összetételű táptalajon: 5 g élesztőkivonat 10 g tripton 55 5 g nátrium-klorid 1 liter vízben, pH 7,4. Fentiek alapján a találmány eljárás 5’GGCC-specifikus restrikciós endonukleáz előállítására. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy Bacillus sphaericus törzset (az Országos Közegészségügyi Intézetben le- 60 tétbe helyezve 1976. július 22-én 00152 számon) aerob körülmények között fermentálunk komplex tápanyagforrásként élesztőkivonatot, fehérje-hidrolizátumot és alkálifémsót tartalmazó táptalajon, majd a fermentléből az enzimet tartalmazó sejteket önmagá- 65 ban ismert módon elkülönítjük és feltárjuk.
