174707. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 4,5-diaril-imidazol-származékok előállítására
19 174707 20 ízületi gyulladásos kontroll kezelt csoport a láb átlag - a láb átlag térfogata (ml) térfogata (ml) X 100 = ízületi gyulladásos — ízületi gyulladáskontroli ban nem szenvedő kontroll a láb átlag a láb átlag térfogata (ml) térfogata (ml) a kontroll átlag térfogat csökkenése % A csökkenés százalékos értékének dózis-válasz regressziós vonalait szemi-logaritmusos papíron szemmérték szerint ábrázoljuk és a kontroll láb-térfogatból meghatároztuk az ED50% csökkenését. Nem-szokásosan használt adjuváns által előidézett arthritis patkányoknál Elsősorban a vegyületeknek indukciós folyamatban szerepet játszó immun-reakciókra és az arthritis kialakulásának megakadályozására gyakorolt hatásának meghatározására alkalmas tesztet használtunk. 130—150 g súlyú Charles River Lewis hím patkányokat a jobb hátsó talpukon sub cutan beoltunk - 0,1 ml adjuvánssal (Difco hőkezeléssel elölt, 5 mg/ml ásványolajban szuszpendált liofilizált Mycobacterium butyricum). 40 arthritisben nem szenvedő kontrollállatot ásványolajjal fecskendeztünk be. 20 patkányból álló csoportnak a vegyületet 10ml/kg mennyiségben tartalmazó „PVA-Acacia” oldószerben vagy az oldószert adjuk be naponta egyszer szondával, rögtön azután, hogy 14 dózist a lábba fecskendeztünk. A bal láb térfogatát - ahová nem adtunk injekciót - az utolsó dózis után 24 órával Ugo Basile Volume Modell 7101 differenciál mérőműszerrel mértük. A kontrolihoz képest az ED50% csökkenést a fenti módon határoztuk meg. A vegyületek immun-szabályozó tulajdonságainak további kiértékeléséhez még két teszt-módszert alkalmaztunk. A Jeme Hemolitikus Trombocita módszerrel a vegyületek specifikus antitest termelő sejtekre gyakorolt hatása mérhető (B limfociták). A B limfociták és a T limfociták viszonylagos aránya (a sejt által közvetített immunitás) meghatározása immun fluoreszcens módszerrel történik. Módosított Jerne-féle lépsejt hemolitikus trombocita mérési módszer N. K. Jeme és A. A. Nordin [Science, 140, 450 (1963)] módosított módszerét alkalmaztuk. Adjuváns által előidézett arthritisben szenvedő és nem szenvedő kontroll Charles River Lewis patkányoknak naponta egyszer adagoltunk be PVA—Acacia oldószert vagy az oldószerben oldott vegyületeket az adjuváns befecskendezése utáni 14. naptól a 20. napig. Az állatokat juh vörös-vérsejtekkel szenzitizáltuk (10%-os szuszpenzió 0,2 ml-e = 2-3 x 10* sejt) intravénásán a 17. napon. A juh vörösvérsejteket a befecskendezés előtt 3-szor mossuk 0,9% nátrium-klorid oldattal. A 21. napon a patkányokat 1%-os nátrium-pentobarbitállal intraperitoneálisan érzéstelenítettük és a lépüket eltávolítottuk. A lépeket egyenként egy jégfürdőben levő műanyag csőpohár fölött felfüggesztett rozsdamentes acélszitára helyezzük és egy üveg injekciós fecskendővel enyhén maceráljuk. A sejteket a szitán keresztül körülbelül 10 ml Eagle-féle „Minimal Essential Medium” (MEM) folyadékkal pásztor pipetta alkalmazásával a puhítási művelet során a pohárba mostuk, ezt a műveletet addig folytattuk, amíg csak szálas anyag maradt fenn a szitán. A nagyobb részecskéket 5 percig hagytuk ülepedni és a felülúszóból 5 ml-t egy műanyagcsőbe vezettük át. Hideg MEM-ben 1:10 és 1 :20 arányú hígításokat végeztünk. Lemeztenyésztés: 2 ml 0,7%-os agarózt (1,4%-os 2 x Eagles MEM-folyadékkal hígítjuk) és 0,2 ml 10%-os juh vörösvérsejt szuszpenziót 45 °C-os vízfürdőn előmelegítünk. 20 lambda mennyiségű [1 X = 1 mikroliter (jul)} lépsejt hígítást adunk hozzá, enyhén összekeverjük és egy hordozó rétegbe öntjük, amely 2 ml 1,4% agarózból áll egy 60 x 15 mm petri-csészében. A lemezeket 37 °C-on 1,5 óráig egy nedvesített inkubátorban inkubáljuk. 1,5 ml 1 :10 arányban „MEM”-mel hígított tengerimalac komplementet adunk hozzá és még 1 óráig folytatjuk az inkubálást. A hemolízis zónákat (lemezeket) nagyítás nélkül csészénként diffúz fényforrás mellett megmértük. Feltételeztük, hogy minden lemez egy lépsejtből képződött hemolizinből jön létre és így minden hígításra a lemezképző sejtek száma/millió lépsejt arányt határoztunk meg. Statisztikai számításokat végeztünk (átlag, standard hiba és ,,t”-teszt), így az egyes lépekre kiszámoltuk a lemez képzősejtek/milliós lépsejtszámot minden hígításnál. Patkánylép-B-sejtek immunofluoreszcens antitest festése Módszer A B-sejt % arány meghatározásához Charles River Lewis patkányokat használtunk, melyekkel az adjuvánssal előidézett arthritis kialakulását vizsgáltuk. A patkányok egyszer egy nap kaptak „PVA-Acacia” oldószert vagy gyógyszert oldószerben. A kezelést az adjuváns adagolás előtt 3 nappal kezdtük. A 0. napon a patkányok bal hátsó lábát sub cutan beoltottuk 0,1 ml (5 mg/ml) Difco szárított hővel elölt Mycobactericum-mal ásványolajban. A gyógyszerrel történő kezelést 7 napig folytattuk. A 8. napon kivettük az állatok lépét. Lépsejt szuszpenziókat készítettünk oly módon, hogy a lépeket rozsdamentes acélszitán RPMI-1640 közegbe maceráltuk. A nagy részecskéket hagytuk leülepedni és a felülúszót tiszta csövekbe vezettük át és 800 percenkénti fordulatszám mellett IEC centrifugáltuk 10 percig International Centrifuge Modell K 2 méretű centrifugán. A sejtmagot 0,83%-os ammónium-kloridban újraszuszpendáljuk (a pH-t nátriumhidroxiddal 7,0-ra 5 10 IS 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
