174707. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 4,5-diaril-imidazol-származékok előállítására

21

174707

22

igazítjuk), hogy a vörös sejteket feloldjuk (körülbelül 1 rész sejt, 3 rész ammónium-klorid). A szuszpenziókat 5-7 percig jégben tartjuk, majd 10 percig 800 percenkénti fordulatszámmal centrifugáljuk. A sejteket kétszer mossuk Dulbecco-foszfát-pufferolt konyhasó oldattal, majd ugyanebben szuszpendáljuk. A végső sejt-koncentráció olyan, hogy egy csöpp sejt-szuszpenzió a mikroszkóp fedőlemezekkel fedett lemezére, 10-15 sejtet eredményez nagyteljesítményű látómezőnként. A sejtmag méretéből és gyakorlatból ítélve 8-10 ml Dulbecco-féle foszfát-puffer-konyhasó-oldatot adunk lépenként a végső sejtszuszpenzióhoz.

Az immunfluoreszcens festéshez 0,2 ml sejt-szuszpenziót 0,2 ml 1:4 hígítású Fluoreszcein-izocianáttal párosított nyúl-anti-patkány IgG (Miles-Yeda Laboratories)-vel kevertük össze. A sejteket 2-4 °C-on 1 óráig inkubáltuk, 800 percenkénti fordulatszámmal 10 percig centrifugáltuk, kétszer 2 ml Dulbecco-féle foszfát-puffer-konyhasó-oldattal újraszuszpendáltuk. A sejt-szuszpenzió egy csöppjét mikroszkóplemezre helyeztük, fedőlemezzel befedtük és fénynél és fluoreszcens mikroszkóppal megvizsgáltuk. Lépszuszpenziónként 200-300 sejtet számoltunk meg.

A fluoreszkáló lymphocyták vagy B-sejtek számát százalékban fejeztük ki.

A fenti kísérletek eredményeit az V., VI. és VII. táblázat mutatja.

A találmány szerint előállított vegyületek a patkányok kifejlett arthritise kezelésében (gyulladás-gátló hatás) és a nem kifejlett arthritisben szenvedő patkányok arthritisének kialakulása megelőzésében egyaránt hatásosak (lásd V. táblázat).

Standard gyulladásgátlók, például indometactn és fenilbutazon kevésbé hatásosak a patkány arthritis kifejlődésének megelőzésében, mint az előrehaladott arthritisnél fellépő gyulladás kezelésében. Egy 5 immunoszupresszív gyógyszer, mint például a ciklofoszfamid, a patkányarthritis kifejlődésének megelőzésében hatásosabb, mint a patkány előrehaladott arthritise kezelésénél.

A találmány szerint előállított vegyületek egyelő dülálló tulajdonságokat mutattak.

Az adjuváns által előidézett arthritises patkányok immunológiai rendszere nagyban megváltozott, ahogy a lépsejt szuszpenziókban a lemez-képző (antitest-termelő) sejtek számának megnöveke- 15 dése jelzi (hemolitikus lemez vizsgálat) (VI. táblázat).

Az arthritises patkányok kezelése a találmány szerint előállított vegyületekkel a normális felé csökkentette a lemezképző sejtek számát. Az indo- 20 metacinnak nem volt ilyen irányú hatása, míg a ciklofoszfamiddal való kezelés messze a normális alá redukálta a lemezképző sejtek számát. A találmány szerint előállított vegyületek kiemelkedő hatást mutattak a vizsgálat során.

25 Az adjuvánssal előidézett arthritises patkányokból nyert lépsejt szuszpenziók nagyobb arányban tartalmaznak B lymphocitákat (antitest termelő), mint T lymphocytákat (sejtimmunitás közvetítők) normális patkányok sejtjeihez viszonyítva. (VII. táb- 30 lázat.) Az arthritises patkányokat a találmány szerinti vegyülettel kezelve a lymphocyta B arányt normálisra lehet csökkenteni. Az indometacinos kezelés nem hatott a lymphocyta populációra, a ciklofoszfamidos kezelés viszont a normális alá 35 csökkentette a lymphocita B arányt.

I. táblázat

4,5-Diaril-2-szubsztituált-tio-imidazolok és hatásuk a patkányok adjuvánssal előidézett arthritisére

(IV. általános képletű vegyület)

Adjuváns által

Példa

X

Y

R

Op.

előidézett arthritis (EDS0%)2 (mg/kg)

15.

4-CH3O-4-CH3O-ch3

156-157°C

4,4

26.

4—Cl

4-Cl-ch3

241-242 °C

3,0

27.

4—CH30—

4-CH3O-ch3ch2ch2

152-153 °C

9,0

28.

4—F

4-F-ch3

222-223,5 °C

3,5

29.

4-CH3O-4-CH3OCHFj

170,5-172 °C

1,8

30.

H

H-chf2

227-228 °C

21

31.

4-C1

4-Cl-CHFj

222-223 °C

0,35

32.

4—F

4-F-CHFj

192,5-194 °C

0,42

11