174695. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gentamicin, sziszomicin és garamin előállítására
13 174695 14 8. példa Az 1. példa szerint előállított oltóanyagot, mely a B/l táptalajon fejlődött ki, beoltjuk egy 3 m3 hasznos térfogatú, szénacél szerkezeti anyagú előfermentorba, mely a következő összetételű steril inokulum táptalajt tartalmazza: szójaliszt 30 kg, kukoricakeményítő 30 kg, szacharóz 30 kg, kálciumkarbonát 4 kg, pálmaolaj 3 kg, csapvíz 3000 liter, pH = 6,7 -6,9. Az üzemi oltóanyag előállításához 180 m3 /óra levegőztetést alkalmazunk, a keverő fordulatszáma 180/perc, a hőmérsékletet 35 °C-on tartjuk. Ily módon 42-48 óra alatt az oltóanyag kifejlődik, ekkor átoltjuk egy 35 m3-es hasznos térfogatú csőfermentorba, mely a következő összetételű steril fermentációs táptalajt tartalmazza: szójaliszt 1050 kg, kukoricaliszt 875 kg, kálciumkarbonát 140 kg, kobaltklorid • 2H20 70 g, szójaolaj 40 kg, csapvíz 35000 liter, pH = 6,7-6,9. A fermentációt 32 °C-on folytatjuk le, a levegőztetés mértéke az első 24 órában 1200 m3 /óra, ezután a fermentáció befejezéséig 1800 m3 /óra. 5 napos fermentáció után az összes gentamicin antibiotikum és sziszomicin tartalom 870 E/ml, (ebből a sziszomicin tartalom 110 E/ml) a fermentlé garamin tartalma 70 gamma/ml. A fermentáció befejezésekor a 35 m3 fermentlé pH-ját 2,0-re állítjuk, keverés közben, 20%-os kénsawal. Ezután a savazott fermentlevet vákuumdobszűrőn, perlit szűrősegédanyagot alkalmazva, megszűrjük. A savas szűrlet pH-ját 20%-os nátriumhidroxid oldattal pH = 6,5-7,0-re állítjuk, majd 3,5kg/m3-nyi oxálsavat adunk hozzá, keverés közben. 1 órai kevertetés után a pH-t 7,5-re állítjuk 20%-os nátriumhidroxid oldattal, s a kivált csapadékot — ismét vákuumdobszűrőn, perlit szűrési segédanyagot alkalmazva - kiszűrjük. A szűrletből ezután a gentamicin antibiotikumokat, sziszomicin és a garamint megkötjük Na-formában levő Wofatit, CP-300-as gyantán: 3 sorbakapcsolt ioncserélő oszlopot használunk a szűrt fermentlé megkötéséhez, az oszlopok 50—50 liter gyantát tartalmaznak (oszlopok mérete 300 x 1000 mm). Megkötési sebesség 1,5 m3 /óra. 24 óra alatt a megkötést befejezzük, s vízzel való mosatás után az oszlopokat ellenáramban eluáljuk 4 n vegytiszta kénsavval. A kénsav térfogata 150 liter, az eluálási sebesség 15 liter/óra. összesen 250 liter főeluátumot nyerünk. Az eluátum pH-ját keverés közben trietilaminnal 4,5-re állítjuk, majd aktívszénnel derítjük (2,5 kg Norit C Extra aktív szenet használunk) s 1 órai kevertetés után szűrjük. A szűrletet állandó kevertetés közben 1750 liter metanolba öntjük, félórás további kevertetés után a csapadékot kiszűrjük, majd metanollal és acetonnal mossuk. Végül vákuumban, 40 C-on szárítjuk a csapadékot, s porítjuk. így 26,62 kg gentamicin C bázissal ekvivalens hatóanyagot és 1,4 kg garamint, valamint 1,1 kg sziszomicint tartalmazó 49,6 kg nyers gentamicin szulfátot nyerünk. A 49,6 kg nyers gentamicin szulfátot (amely tehát sziszomicint és garamint is tartalmaz) 150 liter ionmentes vízben feloldjuk. Az oldat pH-ját 20%-os vegytiszta nátriumhidroxid oldattal pH = 7,0-re állítjuk, majd 2 kg aktívszénnel (Norit C Extra) derítjük 1 órai kevertetés után vákuumszűrőn szűrjük, a szűrletet 4 db sorbakapcsolt, egyenként 125 liter NR,+ formában levő Amberlit CG-50 gyantát tartalmazó kromatografáló oszlopon megkötjük, 30 liter/óra sebességgel. Az oszlopot a megkötés után ionmentes vízzel, 12 órán át, ugyancsak 30 liter/óra sebességgel mossuk. Ezután 0,1 n ammóniumhidroxid oldattal megkezdjük a kromatogram kifejlesztését, illetve az egyes komponensek eluálását. Az ammóniumhidroxid oldat adagolás segessége 60 liter/óra, és összesen 4600 liter 0,1 n ammóniumhidroxid oldattal fejlesztjük ki a kromatogramot, illetve a kísérő szennyezéseket eluáljuk, a nem hasznosított gentamicin antibiotikumokat, továbbá a gentamicin B-t, a gentamicin B,-t, a sziszomicint, és a garamint. Az eluálást papír- és rétegkromatográfiás ellenőrzés mellett végezzük, s ennek alapján választjuk ki azokat a frakciókat, melyek a gentamicin B-B^t, garamint, sziszomicint tartalmazzák. (Egy-egy frakció térfogata 60—60 liter.) Az analitikai vizsgálatok alapján egyesítjük a 42—46. frakciókat (ezek tartalmazzák a garamint), az 50—64. frakciókat, (ezek tartalmazzák a gentamicin B-B,-t), és a 75—82. frakciókat (ezek tartalmazzák a sziszomicint). A 85. frakciónál az ammóniumhidroxid koncentrációját 0,3 n-ra emeljük, s így a 93-107. frakciók tartalmazzák a gentamicin C komplexet. (A fel nem tüntetett frakciókat a továbbiakban nem dolgozzuk fel.) Az egyesített 42-46., 50-64. és 75-82. frakciókat külön-külön bepároljuk, a térfogatuk egy-huszadára, míg az egyesített 93—107. frakciót egy-tizenkettedére. A koncentrátumok pH-ját külön-külön vegytiszta 5 n kénsavval pH = 6,0 -ra állítjuk, majd aktívszénnel derítjük, 30 perc kevertetés után vákuumszűrőn szűrjük. Ezután a pH-t kevertetés közben ismét vegytiszta 5 n kénsavval 4,5-re állítjuk, s aktívszénnel derítjük. Keverés és szűrés után a szűrlet pH-ját ismét ellenőrizzük, majd pirogénmentesre szűrjük. A koncentrátumokat tízszeres térfogatú szűrt metanolba csurgatjuk lassú, állandó kevertetés közben. A kivált csapadokokat 30 perc kevertetés után vákuumszűrőkön szűrjük. A termékeket metanollal, majd acetonnal mossuk, ezután a szűrőnedves anyagokat vákuumszárítószekrényben 40 °C-on szárítjuk, végül szitáljuk. Ily módon a következő végtermékeket kapjuk: a) A 42-46. egyesített frakcióból 1,12 kg garamin szulfátot, (a termék 87%-os tisztaságú). b) Az 50-64. egyesített frakcióból 2,1 kg gentamicin B-B[ szulfátot (ez megfelel 1,26 kg gentamicin B-Bt bázisnak, melynek 25%-a gentamicin B], 75%-a gentamicin B, a termék e 2 komponens szulfát sójára nézve 96%-os tisztaságú). c) A 75-82. egyesített frakciókból 1,35 kg sziszomicin szulfátot (ez megfelel 0,796 kg sziszomicin bázisnak, a termék sziszomicin szulfátra nézve 93%-os), d) A 93—107. egyesített frakcióból 34,25 kg gentamicin C szulfátot (ez megfelel 19,55 kg gentamicin C bázisnak, melynek 39,6%-a gentamicin C2, 33,1%-a gentamicin Cj, és 27,3%-a gentamicin Cla, a termék e 3 komponens szulfát sójára nézve 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6S 7
