174695. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gentamicin, sziszomicin és garamin előállítására
15 174695 16 98,5%-os tisztaságú). A végtermékeket a megadott módszer szerint papír-, és rétegkromatográfiás vizsgálattal azonosítottuk. A kapott rétegkromatográfiás Rf értékek: garamin : 26, sziszomicin : 0,22, gentamicin Cla : 0,21, gentamicin C2 : 0,28, gentamicin C, : 0,35. 9. példa A Micromonospora purpurea varietas nigrescens (X-148) MNG-00122 törzs mélyhűtve (-15°C) tárolt vegetatív tenyészetből olyan hígítást készítünk steril desztillált vízzel, hogy a szuszpenzió élő csíratartalma 103 —104/ml legyen. Ennek a szuszpenziónak 1-1 ml-ével beoltjuk a következő összetételű táptalajokat: Aj Pepton 6,0 g, élesztőkivonat 3,0 g, húskivonat 1,5 g, kazeinhidrolizátum 4,0 g, kálium-dihidrogén-foszfát 1,0 g, magnézium-szulfát • 7H20 0,5 g, ammóniumszulfát 3,5 g, L-aszpargin 1,5 g, glükóz 10,0 g, nátriumklorid 0,1 g, kálciumklorid • 6H20 0,1 g, nyomelemoldat 1,0 ml, agar 20,0 g, desztillált víz 1000 ml, pH =7,0. A nyomelemoldat összetétele: bórsav 50 mg, rézszulfát- 5H20 4 mg, káliumjodid 10 mg, vas(III)klorid-6H20 10 mg, mangán szulfát-4H20 40 mg, ammóniummolibdenát 4H20 40 mg, desztillált víz 100 ml. B/ Pepton 6,0 g élesztőkivonat 3,0 g, húskivonat 1.5 g, kálium-dihidrogén-foszfát 1,0 g, magnéziumszulfát - 7H2 O 0,5 g, oldható keményítő 10,0g, nátriumklorid 1,0 g kálciumklorid • 6H2 O 0,1 g, nyomelemoldat 1,0 ml, agar 20,0 g, desztillált víz 1000 ml, pH = 7,0. Ehhez a B/ táptalajhoz 1000 ml térfogatra számolva adagolunk 1,4 g sztreptomicin szulfátot, 2.5 g gentamicin A szulfátot, 1,2 g sziszomicin szulfátot és 1,2 g kobaltklorid • 2H20-t. Az így előkészített steril szilárd táptalajokat oltjuk be a törzs megfelelően hígított tenyészetével. Beoltás után a tenyészeteket 37 °C-on inkubáljuk 8 napig. A kiegészített B/ táptalajon kifejlődött tenyészetet még háromszor átoltjuk, ugyanezt a kiegészített B/ táptalajt és inkubálási körülménye- 5 két használva. Majd az A/ és B/ szilárd táptalajokon kifejlődött tenyészetekből beoltjuk a következő összetételű inokulum és fermentációs táptalajokat, A tenyésztést 28 °C-on, inokulum előállítása esetén 2 napon keresztül, fermentáció esetén 6 10 napon keresztül folytatjuk excenteres síkrázóasztalon (280 fordulat/perc, 2,5 cm lökethossz.) A fermentáció oltásához 5% oltóanyagot használunk. Az alkalmazott táptalajok összetétele a következő: ls A/l. Inokulum táptalaj: burgonyakeményítő 10,0g, szacharóz 5,0 g, élesztőkivonat 5,0 g, kazein hidrolizátum 4,0 g pepton 2,0 g, kálciumkarbonát 4.0 g, kukoricalekvár (sz.a.) 1,0 g pálmaolaj 2,0 g, csapvíz 1000 ml, pH 6,8-7,0. (500 ml-es Erlen-20 meyer lombikban 70 ml táptalaj). A/2. Fermentációs táptalaj: szójaliszt 30,0 g burgonyakeményítő 15,0g, glicerin 15,0 g, kálciumkarbonát 5,0 g, kobaltklorid • 2H20 2 mg, pálmaolaj 2.0 g, csapvíz 1000 ml, pH = 6,6—6,8. (500 ml-es 25 Erlenmeyer lombikban 50 ml táptalaj.) B/l. Inokulum táptalaj: szójaliszt 10,0 g, kukoricakeményítő 10,0g, szacharóz 10,0g, kálciumkarbonát 4,0 g, pálmaolaj 3,0 g, csapvíz 1000 ml, pH = 6,7-6,9. (500 ml-es Erlenmeyer lombikban 30 70 ml táptalaj). B/2. Fermentációs táptalaj: szójaliszt 30,0g, kukoricaliszt 25,0 g, kálciumkarbonát 4,0 g, kálciumklorid • 2H2 O 2,0 mg, pálmaolaj 4,0 g, csapvíz 1000 ml, pH = 6,7-6,9. (500 ml-es Erlenmeyer lom- 35 bikban 50 ml táptalaj.) Az Aj szilárd táptalajon kifejlődött tenyészetet az A/l-A/2, a B/ szilárd táptalajon kifejlődött tenyészetet a B/l —B/2 táptalajokba oltjuk. Megmérjük az inokulum átoltás kori (48 órás) 40 tenyészetében, valamint a fermentáció 48. órájában a tenyészet amiláz és proteáz aktivitását: Inokulum 48 ó Fermentáció 48 ó amiláz m-SKB/ml proteáz fi-A/nú amiláz m-SKB/ml proteáz fi-A/nű Aj táptalajokon kifejlődött tenyészetek enzim aktivitása 15 30 30 25 B / táptalajokon kifejlődött tenyészetek enzim aktivitása 100 150 390 270 A fermentáció befejezésekor az A/3 jelű fermentlé összes gentamicin antibiotikum és sziszomicin tartalma 710 E/mi (ebből a sziszomicin tarta- 60 lom 50 E/ml), garamin tartalma 40 gamma/ml, a B/3 fér mentié összes gentamicin antibiotikum és sziszomicin tartalma 1150 E/ml, (ebből a sziszomicin tartalom 140 E/ml, a garamin tartalom 80 gamma/ml. 65 10. példa A 9. példa szerint előállított 70 ml oltóanyagot, amely a B/l táptalajon fejlődött ki, beoltjuk egy 3 m3-es hasznos térfogatú előfermentorba, mely a következő összetételű steril táptalajt tartalmazza, szójaliszt 30 kg, kukoricakeményítő 30 kg, szacharóz 30 kg, kálciumkarbonát 4 kg, pálmaolaj 3 kg 8
