174541. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens koleszterin meghatározásához
7 174541 8 Kromogénként 2,2’-amino-benztiarç>linszulfonsav alkalmazása előnyös. További előnyös kiviteli alak szerint a találmány szerinti reagens koleszterinoxidázból, az említett mikroorganizmusokból származó koleszterinészteráz preparátumból és ketocsoportokkal hidrazon képződése közben reagáló hidrazin-származékból, valamint adott esetben pufferből áll. Hidrazin-származékként előnyösen 2,4-dinitro-fenü-hidrazint használunk. A fent említett előnyös reagens-kombinációk a felsorolt és előírt alkotórészeken kívül tartalmazhatják még a szokásos oldószereket, stabilizátorokat és/vagy felületaktív anyagokat. Ezeket az adalékanyagokat szakemberek jól ismerik és ezeket a hidrogénperoxid illetve a kolesztenon kimutatásoknál általában alkalmazzák. A fent említett reagens-kombinációk a lényeges összetevőket előnyösen a következő mennyiségi arányokban tartalmazzák: 1. 13-150 E koleszterinoxidáz, 0,05—0,5 mg mikroorganizmusból származó koleszterinészteráz, 2xl04— 5 x 10s E kataláz, 0,05-0,2 ml acetil-aceton és 2—10 ml metanol 100 ml ammóniumion-tartalmú pufferben, pH = 5-7, valamint adott esetben 0,02-0,3 ml felületaktív anyag, előnyösen hidroxl-polietoxi-dodekán. 2. 3—40 E koleszterinoxidáz, 0,05—0,5 mg mikroorganizmusból származó koleszterinészteráz, valamint 2xl01 2-lxl04 E peroxidáz, 50-200 mg 2,2’-amino-benztiazolinszulfonsav, valamint adott esetben 0,05-0,5 ml felületaktív anyag, előnyösen hidroxi-polietoxi-dodekán, 100 ml pufferben, pH = 6-8. 3. 0,1-1 E koleszterinoxidáz, 0,05—0,5 mg mikroorganizmusból származó koleszterinészteráz, 1-5 ml 2,4-dinitro-fenil-hidrazin 1 millimólos oldata, valamint adott esetben 0,005-0,1 ml felületaktív anyag, 10 ml pufferben pH = 6-8. 4. 2—100 E koleszterinoxidáz, 0,05-0,5 mg mikroorganizmusból származó koleszterinészteráz, valamint adott esetben 0,1—2,0 ml felületaktív anyag (előnyösen hidroxi-polietoxi-dodekán), 50 ml pufferban, pH = 5-9, előnyösen 0,5 mól nátriumfoszfát pufferben, pH = 7,5. A találmány szerinti eljárással és reagenssel rendkívül gyorsan és teljesen el lehet szappanosítani a kötött koleszterint. Például, a koleszterin koleszterinoxidázzal való meghatározásának reakciókörülményei között a találmány szerint a kötött koleszterin kvantitatív hasítható 1 -3 perc alatt, ha a Candida rugósa ATCC14830 vagy Aspergillus sp. WS 90030 acetonnal szárított porából 0,1 -0,3 mg-ot adagolunk hozzá. A találmány szerinti eljárást az alábbi példákban ismertetjük részletesebben. 1. példa A 2 224 132 számú Német Szövetségi Köztársaság-beli nyilvánosságrahozatali irat 1. példájában leírt eljárással egy szérumban 63 mg% (63 mg 100 ml-ben) szabad koleszterint határozunk meg. A kötött koleszterin meghatározásához a szérumból egy összehasonlító mintát alkoholos kálilúggal 70°C-on kezelünk. Semlegesítés után újra megmérjük a jelenlevő koleszterint, így 181 mg% összes koleszterin-tartalmat kapunk. Ebből az következik, hogy 118 mg/100 ml koleszterin kötött formában van jelen. Az eljárást kezeletlen szérummal megismételjük és a meghatározás elején (proteinra számolva) a Candida rugósa ATTC14830 acetonnal szárított, kereskedelemben kapható porának 0,3 mg-nyi mennyiségét adjuk hozzá. 3 perc múlva polarográfiásan 183 mg% összes koleszterin-tartalmat mérünk. 2. példa A Candida rugósa ATCC 14830 kereskedelemben kapható, acetonnal szárított porát a koleszterinészteráz aktivitás fokozása érdekében káliumfoszfát-pufferben oldjuk, (pH = 6,0) és azonos pufferrel szemben dializáljuk. A stabilizátorként használt laktóz eltávolítása után 0,3 E/mg protein specifikus koleszterinészteráz-aktivitást kapunk a dializált oldatban. Az így kapott oldatot összekeverjük dextrán-alapú, dietil-amino-etanol-csoporttal modifikált ioncserélővel, az ioncserélőt elkülönítjük és 0,2 mólos 6,0 pH-jú foszfátpufferrel eluáljuk. Az eluátumban a specifikus koleszterinészteráz-aktivitás 1,2 E/mg. Az így kapott oldatot ammóniumszulfáttal frakcionáljuk, az 1,8 és 2,4 mól ammőniumszulfát között kicsapódó protein-frakciót elkülönítjük. Ez a frakció 2,5 E/mg specifikus koleszterinészteráz-aktivitást mutat. Az így kapott terméket 6,0 pH-jú foszfát-pufferben újra feloldjuk^ azonos pufferrel szemben só-mentességig dializáljuk és azután egy oszlopon kromatografáljuk, amelyet a fent megadott anioncserélővei töltöttünk meg. Az eluálást 6,0 pH-jú 0,2 mólos foszfát-pufferrel végezzük. A frakcióban a specifikus koleszterinészteráz-aktivitás 7 E/mg protein. Az így kapott, dúsított koleszterinészteráz-preparátumot az 1. példában leírtak szerint használjuk koleszterin meghatározásra. A felhasznált mennyist azonban csupán 0,001 mg, proteinre vonatkoztatva. Az eredmény megfelel az 1. példában leírtaknak. A Candida rugosa-ból származó koleszterinészterázt az enzimek finomításánál használatos módszerekkel tisztíthatjuk tovább. Az említett dúsítási műveletek helyett más biokémiai tisztítási módszerele is- alkalmazhatók, például kicsapás, illetve frakciónál^ polietüén-iminnel, szerves oldószerekkel vagy sókkaf, kröírtitOgrafálás molekulaszűiőn va&r jjyengeánibncserflő oszlopon — amely más funkciós ctopbrtöWtalT^ delkezik, mint a diétil-amino-etanol-csöport-piotanwtszulfátos kicsapás és hasonlók. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
