174541. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens koleszterin meghatározásához
9 174541 10 3. példa 0,5 ml szérumhoz, illetve koleszterin standardhoz 1,0 ml 0,5 mólos 7,5 pH-jú káliumfoszfát - -puffert adunk, amely 0,4% hidroxi-polietoxi-dodekánt tartalmaz, továbbá 2,5 E, 2. példa szerinti koleszterinészterázt. Ezt a reakciókeveréket 40 percig 37 °C-on inkubáljuk. Ezután ebből az oldatból 0,25 ml-t hozzáadunk 3 ml koleszterinreagenshez, amely két rész ecetsavat, három rész ecetsavanhidridet és egy rész kénsavat tartalmaz (Liebermann-Burchardt reagens). A fenti oldal standardnak alapértékként való alkalmazásával, egy mintában 170 mg% összkoleszterint találunk. Az összehasonlító vizsgálat — amelyet a koleszterinészter alkoholos kálilúggal való elszappanosításával végzünk - eredménye 165 mg%. 4. példa 0,02 ml szérumot összekeverünk 10 ml 0,5 mólos, 0,4% hidroxi-polietoxi-dodekán-tartalmú káliumfoszfát-pufferrel és 0,2 E koleszterinészterázzal, a 2. példa szerint. A reakcióoldatot 60 percig 37 °C-on inkubáljuk. Azután leolvassuk az extinkciót (Ex ) 240 nm-nél egy megfelelő spektrofotométeren és a reakciót Brevibacterium sterolicumból származó 0,1 E szterindehidrázzal beindítjuk. 15 perc után újra leolvassuk az extinkciót (Ej). A képződött A4-kolesztenon és ezzel a koleszterin koncentrációját az első és második leolvasás közötti különbségből kapjuk meg, figyelembe véve a A4 -kolesztenon moláris extinciós koefficiensét 240 nm-nél. Egy minta mérésénél 183 mg% összes koleszterint kapunk. Szterindehidráz helyett Nocardia erythropolis-ból származó koleszterinoxidázzal végzett összehasonlító vizsgálatnál 181 mg% összes koleszterint kapunk. 5 5. példa 10 g diammóniumhidrogénfoszfátot 100 ml vízben oldunk és 85%-os foszforsavval a pH-t 7-re állítjuk be. Ezután 10s E katalázt teszünk hozzá. Az így kapott oldattal 0,2 ml acetil-aceton, 10 ml metanol és 0,1 g hidroxi-polietoxi-dodekán elegyét 100 ml-re töltjük fel. Ehhez az oldathoz Rhizopus spec. WS 90027-ből származó 2,5 E koleszterinészterázt adunk. Az így kapott oldatból 5 fi ml-t 0,02 ml szérummal, illetve 0,02 ml 200 mg% koleszterin-tartalmú koleszterin standard oldattal keverünk. A szérum-tartalmú illetve a koleszterin-standard-tartalmú minta alikvot részéhez 0,1 E koleszterinoxidázt adunk és 60 porcig 37 °C-on inkubáljuk. Ezután a képződött szín intenzitást 405 nm-nél foto metrikusan mérjük, a vakpróba figyelembevételével. A szérum-tartalmú minta koleszterin-tartalma - standard alapérték alkalrmzésával - 154mg% összes koleszterin. A kontroll meghatározás, amelyet Candida rugósa ATCC 14830-ból származó koleszterinészterázzal és Rhizpous spec. WS 90027-ből származó koleszterinészterázzal végzünk, azonos értéket eredményez. 6. példa Aspergillus spec. WS 90030 szokásos módon előállított, acetonnal szárított porát káliumfoszfát-pufferben (pH = 6,5), oldjuk és azonos pufferrel szemben dializáljuk. A dializátumban 0,25 E/mg protein fajlagos koleszterinészteráz-aktivitást kapunk. A dializátumot összekeverjük cellulózbázisú, dietil-amino-etanol-csoportokkal módosított ioncserélővel, az ioncserélőt elkülönítjük és 0,25 mólos foszfát-pufferrel, pH = 6,5, eluáljuk. Az eluátum 1,0 E/mg fajlagos koleszterinészteráz-aktivitású. Az így előállított oldatot ammóniumszulfáttal frakcionáljuk. Az 1,8 és 2,4 mól ammóriiumszulfát között kicsapódó protein-frakciót elkülönítjük, ennek 2,2 E/mg a fajlagos koleszterinészteráz-aktivitása. A kapott terméket ismét feloldjuk foszfát-pufferben, pH = 6,5, azonos pufferrel szemben sómentesre dializáljuk, majd olyan oszlopon kromatografáljuk, amit a fentiekben megadottal azonos ioncserélővel töltöttünk meg. Az eluálást ismét 0. 22 mólos foszfát-pufferrel, pH = 6,5, végezzük. A koleszterinészteráz-frakcióban a fajlagos aktivitás 6,5 E/mg protein. Az így kapott, dúsított koleszterinészteráz-készítményt az 1. példában ismertetett módon alkalmazzuk koleszterin meghatározására. Az alkalmazott mennyiség azonban, proteinre vonatkoztatva, csupán 0,001 mg. Az eredmény megfelelt az 1. példáénak. 7. példa 0,5 ml szérumhoz, illetve koleszterin-standardhoz 1,0 ml 0,5 mólos, 0,4% hidroxi-polietoxi-dodekánt tartalmazó káliumfoszfát-puffert (pH = 7,5), és 2,5 E, 6. példa szerinti koleszterinészterázt adunk. A koleszterin meghatározását a 3. példában ismertetettekkel azonos módon végezzük. Egy standard alapértékként való alkalmazásával egy mintánál 175 mg% össz-koleszterint találtunk. A koleszterinészter alkoholos kálilúggal való elszappanosításával kapott összehasonlító vizsgálat szerint az össz-koleszterin 171 mg%. 8. példa Actinomyces griseomycini WS 90004 acetonos szárítással kapott porát káliumfoszfát-pufferrel (pH = 6,0), extraháljuk és káliumfoszfát-pufferrel (pH = 6jO), szembeni dialízis után összekeverjük dextránbázisú, diet il-a mi no-etanol-cso portokkal módosított ioncserélővel, majd az ioncserélőt elkülönítjük és 0,15 mólos foszfát-pufferrel (pH = 6,0), eluáljuk. Az eluátumban a fajlagos koleszterinésztefiz-aktivitás 5 E/mg- Az így kapott, dúsított kolesz-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
