174541. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens koleszterin meghatározásához
5 174541 6 Pénicillium spec. WS 90028 Aspergillus spec. WS 90029 A mikrobiológiai eredetű előnyös koleszterinázok mellett más eredetű koleszterinázok is sok esetben alkalmazhatók. Már említettük, hogy a találmány szerinti eljárás különösen lényeges előnye, hogy teljesen enzimatikus összes koleszterin meghatározás végezhető általa. Ennél nagyon fontos, hogy a mikroorganizmusokból származó előnyös koleszterinészteráz-preparátummal a koleszterin észtereiből gyorsan és kvantitatív módon szabaddá tehető. Főleg a fent említett előnyös mikroorganizmusokkal érhető el, hogy ezek nagyon kis mennyiségének közvetlen hozzáadásával és az ezt követő, enzimatikus koleszterin meghatározás által megkívánt pH-érték, valamint hőmérséklet betartásával néhány percen belül a koleszterin kvantitatíve szabaddá váljon. Ennek soránt azt találtuk, hogy a szénhidrát-bázisú szokásos stabilizáló anyagok, amelyet az ilyen mikroorganizmusokhoz alkalmaznak, nem zavarják a találmány szerinti, koleszterin meghatározásának teljesen enzimatikus eljárását. Már említettük, hogy a találmány szerinti eljárásban mikroorganizmusból származó szétválasztott és dúsított koleszterináz is alkalmazható. Megfelelő dúsítást úgy érhetünk el, hogy acetonnal szárított mikroorganizmusból vagy más biológiai anyagból indulunk ki, ezt dializáljuk, majd gyengén lúgos anioncserélővei és ammóniumszulfátos frakcionálássál kezeljük. Ezzel a módszerrel könnyen elérhető a koleszterinészteráz 20-30-szoros dúsítása. Gyengén lúgos anioncserélőként különösen előnyös egy szénhidrát-bázisú, dietil-amino-etanol-csoportokkal modifikált preparátum. Az ammóniumszulfátos frakcionálási előnyösen 1,8—2,4 mólos ammóniumszulfáttal végezzük. Az így kapott enzim-frakciót azután előnyösen az említett ioncserélő anyagon kromatografáljuk. A találmány szerinti eljárással különösen jó eredményeket kapunk olyan mikroorganizmusokkal, amelyeket koleszterinészter-tartalmú táptalajon tenyésztettünk. Ebben az esetben a koleszterinésztert vagy a koleszterinészter-keveréket a tenyésztés alatt egyedül használhatjuk szénfonásként, vagy más szénforrásokkal együtt is alkalmazhatjuk. Különösen előnyös olyan mikroorganizmusok használata, amelyeket több fokozatú tenyésztési eljárással kapunk, ahol az első fokozatban egy alkalmas szénforrást, például glicerint, a második fokozatban pedig koleszterinésztert alkalmazunk. Ilyen megfelelő tenyésztési eljárást ismertet például a 2 244 133 és a 2 307 618 számú Német Szövetségi Köztársaság-beli nyilvánosságrahozatali irat. A találmány szerint előnyösen alkalmazott, Candida rugósa ATÇC 14830-ból származó koleszterinészteráz gyengén savas közegben 5—6,5 pH-nál nagyon stabil. Az enzim pH-jának optimuma 7,5. Az enzim sajátot tulajdonsága, hogy a katalitikus reakció különösen jól megy végbe a reakcióközeg viszonylag magas só-tartalma esetén. Előnyösen 0.2-0.8 mólos, főleg O/t-0,6 mólospufferoMatban dolgozunk. A pH-ért& 4,5-7,5 között lehet» előnyös a már említett 5,-6,5 pH-érték. A koleszterinészteráz hatását felületaktív anyagok hozzáadása előnyösen növeli. Különösen előnyös hidroxi-polietoxidodekán adagolása. Már említettük, hogy különösen előnyös a találmány szerinti eljárás teljesen enzimatikus foganatosítása azaz, hogy a koleszterin felszabadítását követő meghatározása is enzimatikus és előnyösen koleszterinoxidázzal történik. Használhatunk azonban koleszterindehidrázt vagy koleszterindehidrogenázt is. A koleszterinoxidázzal való meghatározást például a 2 224 132 számú Német Szövetségi Köztársaság-beli nyilvánosságrahozatali irat ismerteti. Az ott leírt eljárást előnyösen kombinálhatjuk a találmány szerinti eljárással. Elvileg az oxigén-felhasználást, a hidrogénperoxid-képződést vagy a kolesztenon-képződést lehet mérni. Az oxigén-felhasználás például gázkromatográfiásán, polarometriásan vagy polarizációs eljárással határozható meg. Ezek a módszerek önmagukban ismertek. A képződött hidrogénperoxid titrimetriásan, potenciometriásan, polarográfiásan, kolorimetriásan, valamint enzimatikusan lehet meghatározni. Előnyös, ha az enzimatikus meghatározást kataláz vagy peroxidáz alkalmazásával végezzük, főleg, ha a meghatározást katalázzal 0-diketonok — például acetil-aceton -, rövidszénláncú alkohol és ammóniumion-tartalmú puffer jelenlétében folytatják le, vagy, ha a meghatározást peroxidázzal egy kromogén, például 2,2’-amino-benztiazolinszulfonsav jelenlétében végezzük. A kolesztenont ketoreagensek segítségével, például 2,4-dinitrofenilhidrazinnal vagy fotometrikusan határozzuk meg 240 nm-nél. Abban az esetben, ha az összes vagy a kötött koleszterint teljesen enzimatikusan koleszterinoxidázzal határozzuk meg, előnyösen olyan koleszterinoxidázt használunk, amely a Nocardia erythropolis ATCC 17895-ből, Nocardia erythropolis ATCC 4277-ből, Nocardia formica ATCC 14811-ből vagy Proactinomyces erythropolis NC I 9158-ból származik. A találmány tárgya továbbá olyan reagens a koleszterin meghatározására, amely koleszterinészterázból és a szabad koleszterin meghatározására szolgáló rendszerből áll. Ez a reagens előnyösen mikrobiológiai eredetű koleszterinészterázból, koleszterinoxidázból és olyan rendszerből áll, amely alkalmas hidrogénperoxid vagy kole6ztenon meghatározására. Nagyon előnyös, ha ebben a reagensben a koleszterinészteráz a fentemlített mikroorganizmusokból, főleg ezek acetonnal szárított porából, vagy az előbb kapott koleszterinészteráz aktivitású protein frakcióból származik. Speciális és előnyös kiviteli alak, ha ez a reagens koleszterinoxidázból, a fent említett mikroorganizmusokból származó koleszterinészteráz-preparátumból, katalázból, acetil-acetonból, metanolból és ammóniumion-tartalmú pufferből áll, külön-külön vagy keverve. További előnyös kiviteli alak, ha a reagens koleszterinoxidázból, a fentemlített mikroorgaizmusokból származó koleszt er inészt eráz•aktivitású preparátumból, peroxidázból, kromogénből és pufferből áll, külön-külön vagy keverve. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
