174541. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens koleszterin meghatározásához
3 174541 4 elszappanosítható. Ez az élj árás «különösen abban az esetben előnyös, lia a szabad koleszterin ezt követő meghatározása enzimatikusan, például koleszterinoxidázzal vagy koleszterindehidrázzal történik. Ebben az esetben a találmány szerinti eljárással a koleszterint teljesen enzimatikusan lehet meghatározni, és ezzel lehetővé válik az orvosi rutin diagnosztika döntő megjavítása, valamint az eljárás könnyű alkalmazása analizáló automatákra. Már régóta ismeretes volt, hogy a pankreásznak, a májnak és a Nocardia restrictusnak koleszterinészteráz-hatása van. De ebből még nem következhetett, hogy ezek az enzimek a koleszterinészter gyors és teljes elszappanosítására alkalmasak lennének kvantitatív analitikai eljárásban, mert a megállapított hasadási arány nem volt kvantitatív, hanem csak maximum 80% [Biochimica et Biophysica Acta 270 (1972) 156-166], Továbbá, a kötött koleszterin a biológiái anyagokban nagyon különböző savakkal alkot észtereket. Valamely analitikai eljárás használhatóságának az az előfeltétele, hogy minden előforduló észter közel azonos sebességgel és azonos megbízhatósággal kvantitatív hasadjon. Ezeknek az enzimeknek az ismert tulajdonságai alapján meglepő, hogy a koleszterinészterázok az összes előforduló koleszterin-észtert nagyon rövid idő alatt kvantitatív hasítják. Ez a megállapítás főleg azért is meglepő, mert ismeretes, hogy az ismert koleszterinészterázok jelentős különbséggel hatnak a különböző koleszterinészterekre. Különösen előnyös, hogy a találmány szerinti eljárás során mikroorganizmusokból származó koleszterinészterázokat alkalmazunk. Ezek a hasítási sebesség és a különböző koleszterinészterekkel szembeni hatás szempontjából felülmúlják a más eredet ű koleszterinészt erázokat. Azt találtuk továbbá, hogy különböző mikroorganizmusok különösen aktív koleszterínészerázokat tartalmaznak, ezért a találmány szerinti eljárásban ezeket a koleszterinészterázokat külön elkülönítés és tisztítás nélkül közvetlenül is használhatjuk. Ez a különösen egyszerű hozzáférhetőségen kívül azért is előnyös, mert a koleszterinészteráz elkülönítésének és dúsításának elhagyásakor elkerülhető az a veszély, hogy különböző koleszterinészterekre specifikus koleszterinészterázok gyakorlatban előforduló keverékéből elkülönítenek egy olyan vegyületet is, ami az összes kötött koleszterin kvantitatív meghatározását nagyon megnehezítené. Ehhez járul továbbá, hogy a többnyire lipoidmembránokhoz kötött koleszterinészterázok tisztítása meglehetősen körülményes és az így kapott készítmény az ára miatt a rutindiagnosztikára kevésbé alkalmas, mint a tisztítás nélküli mikroorganizmus-preparátum. Különösen jó eredményeket kaptunk a találmány szerinti eljárásban olyan koleszterinészterázok alkalmazásával, amelyeket Candida rugósa (amit Cylindracea-nak is neveznek) ATCC 14830-ból, illetve WS 90031-bői és Aspergillus spec.-bői (WS 90030) állítottak elő. A találmány szerinti eljárásban mindkét mikroorganizmus közvetlenül előforduló alakjában felhasználható, vagy feltárva, például acetonnal készített száraz por formájában alkalmazható. Természetesen ugyanúgy felhasználható az ezekből a mikroorganizmusokból készített dúsított koleszterinázpreparátum is, melynek az a nagy előnye, hogy bizonyos dúsítás itt nagyon egyszerűen létrehozható. Az említett Candida rugósa nagyüzemileg előállított mikroorganizmus, amely a kereskedelemben kapható. A szokásos kereskedelmi formája laktózzal stabilizált acetonnal készített száraz por, amely a találmány megvalósítására nagyon előnyösnek bizonyult. Hasonló kedvező tulajdonságokat találtunk a következő mikroorganizmusoknál is: Actinomyces aureoverticillatus WS 90002 Actinomyces cyaneofuscatus WS 90003 Actinomyces griseomycini WS 90004 Actinomyces longisporus-fl. WS 90005 Actinomyces malachiticus WS 90006 Actinomyces roseolus WS 90007 Actinomyces toxytricini WS 90008 Actinomyces variábilis WS 90009 Streptomyces spec. WS 90010 Streptomyces autotrophicus WS 90011 Streptomyces canescens WS 90012 Streptomyces chartreusis WS 90013 Streptomyces michiganensis WS 90014 Streptomyces murinus WS 90015 Streptomyces hachijoensis WS 90016 Streptomyces caelestis WS 90017 Streptomyces tendae WS 90018 Nocardia rubra WS 90019 Candida mycorderma WS 90020 Candida albicans WS 90021 Candida albicans WS 90022 Candida albicans WS 90023 Candida spec. WS 90024 Cunninghamella elegáns WS 90025 Mucor mucedo WS90Ö26 Rhizopus spec. WS 90027 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
