174539. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új BU-2183 antibiotikumok előállítására
27 174539 28 (percenkénti 250-es fordulatszámú) forgó rázóasztalon, majd ezen oltóközeg 1 liternyi mennyiségével 300 liter 100F jelű fermentációs táptalajt (2% glicerin, 1% Pharmamedia, 2% halliszt, 2% lenmagolaj, 0,3% ammónium-szidfát, 0,6% kalcium-karbo- 5 nát) oltunk be. 30 °C-on, percenként 140-es fordulatszám keverővei kevertetve, 200 liter/perc levegőztet ési sebesség mellett végezzük a tankfermentálást. A papírkorongos-agarlemezes módszenei, értékmérő mikroorganizmusként B. subtilis PCI 219-et, érték- 10 mérő standardként pedig Bu-2183 A-t használva határozzuk meg a fermentlé kező eredményeket nyerjük: aktivitását. A követ Idő A fermentlé Aktivitás (óra) pH-ja (mikrogramm/ ml) 0 6,7 0 20 7,5 200 30 7,8 400 40 7,9 1600 50 7,9 1650 60 8,1 1700 64 8,1 1800 0,05 normál ammonium -hidroxid-oldat A szilárd anyag súlya Nyers Bu—2183 komponens 0 - 1,3 literaktivitás nincs — 2,5 liter 2,7 g A- 4,4 liter 7,8 g A + (kevés) B — 5,2 liter 3,3 g B 3. példa (Bu—2183 A előállítása) Vízben feloldjuk a Bu—2183 A-nak a 2. példában leírt módon nyert nyers mintáját (2,7 g), és egy Amberlite CG-50 ioncserélő gyantával töltött (NH4+-fázis, 80 ml) oszlopra visszük fel az oldatot. 0,05 normál ammónium-hidroxid-oldattal eluáljuk az oszlopot, frakciószedővel 15 ml-es frakciókat szedünk. Vékonyrétegkromatográfiával (ninhidrines előhívás) és biológiai értékméréssel vizsgáljuk a frakciókat, egyesítjük, és csökkentett nyomáson betöményítjük a megfelelő frakciókat, majd liofílizáljuk a maradékokat, ily módon a következő, szilárd halmazállapotú anyagokat nyerjük. 2. példa (Extrakció) A szilárd Vékonyrét eg-35 Frakciószám anyag súlya kromatográfiás vizsgálat A kész fermentlevet 2-es pH mellett, szűrési segédanyag hozzáadása után szűrjük. A 19 liternyi térfogatú, kb. 30 g Bu-2183 A aktivitású szűrlet 40 pH-ját 7-re állítjuk be, és 3 liter (NH4+-fázisú) Amberlite IRC—50 kationcserélő gyantával keverjük. Elkülönítjük a gyantát, egymás után 10 liter vízzel, majd 5 liter 0,02 normál ammónium-hidroxid-oldattal mossuk, majd a bioaktív anyagok 45 eluálása céljából kétszer 4 liter 0,5 nomrál ammónium-hidroxid-oldattal kevertetjük. Egyesítjük. és csökkentett nyomáson betöményítjük az aktív eluátumokat, majd liofilizáljuk a maradékot. Dy módon 18,6 g fehér színű szilárd halmazállapotú 50 anyagot nyerünk (aktivitása kb. 700mikrogramm/mg). Vízben feloldjuk ezt a szilárd halmazállapotú anyagot, és egy Amberlite CG—50 ioncserélő gyantával (NH* +-fázis, 400 ml) töltött oszlopra visszük fel. 2,2 liter vízzel, majd 3 liter 0/125 55 normál ammónium-hidroxid-oldattal mossuk az oszlopot, majd 0,05 normál ammónium-hidroxid-oldattal eluáljuk. Az eluátumot frakcionálva gyűjtjük, és B. subtilis lemezen végzett biológiai értékméréssel, valamint vékonyrétegkromatográfiával 60 (S—117 jelzésű futtató elegy, ninhidrines előhívás) vizsgáljuk. Egyesítjük, és csökkentett nyomáson betöményítjük a megfelelő frakciókat, végül liofilizáljuk a maradékokat, ily módon a következő, szilárd halmazállapotú termékekhez jutunk: 28—53. 801 mg A + szennyezés 54-72. 1597 mg A 73-95. 189 mg A + (kevés) B A Bu-2183 A tiszta mintájának analízise a C15H31N3O9 * 1 /2H2 CO3 képletre: számított: C =43,45%, H =7,53%, N = 9,81%, talált: C = 43,22%, H = 7,52%, N = 9,49%. Infravörös és NMR-spektrumát az 1. és 2. ábrán mutatjuk be. Az NMR-spektrum adatait az alábbiakban foglaljuk össze: Kémiai eltolódás («, ppm) Kapcsolási állandó (J, Hz) Relatív intenzitás 1,12 t 7,5 3H 2,29 q 7,5 2H 3,1— 3,35 m 2H 14
