174503. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új N-E-trimetil-L-lizin-sók előállítására
3 174503 4 san meghatározható és vizes oldatuk pH-ja azonos vagy megközelítőleg azonos a fiziológiás konyhasóoldat pH-jával. Azt találtuk, hogy ezt a célt az N-e-trimetil-L-lizin (TML) egy vagy két molekula fumársawal, 5 L-aszparaginsavval és L glutaminsavval képezett sóival érhetjük el, különösen az N-e-trimetil-L-lizin-mono-L-glutamát-tal (a továbbiakban TML.Glu). A találmány értelmében úgy állítjuk elő a fenti J0 sókat, hogy N-e-trimetil-L-lizint vizes oldatban L-aszparaginsavval, fumársawal vagy L-glutaminsavval reagáltatunk. Célszerűen oly módon járunk el, hogy a kiindulási anyagok vizes oldatait egyesítjük, majd a 15 reakció lejátszódása után a reakcióelegyet bepároljuk, és a maradékot — szükség esetén átkristályosítás után - megszárítjuk. A kiindulási anyagként alkalmazott L-aszparaginsav, fumársav és L-glutaminsav mennyisége termé- 20 szét esen attól függ, hogy egy vagy két molekula savval alkotott sót akarunk-e előállítani, ennek megfelelően 1 mól TML-re 1, illetőleg 2 mól fumársavat, L-aszparaginsavat vagy L-glutaminsavat alkalmazunk. A találmány szerinti eljárással előállítható vegyületek farmakológiai hatásait az alábbi kísérletekkel szemléltetjük. Megvizsgáltuk a TML.Glu kezelés NK/Ly tumoros egerek vérképére gyakorolt hatását. 50 db, 20—22 g súlyú, 8-hetes CFLP 9 egeret i.p. beoltottunk NK/Ly ascites tumorral (5 • 105 sejt/állat). 25 állat kontrollként szolgált, a másik 25-öt a tumorral való beoltás utáni 2., 5., 9., 11., 13. és 19. napon (ez utóbbin csak az életben levő 5 állatot) 100mg/kg TML.Glu-tal kezeltünk i.p. A beoltás utáni 2., 5., 8., 10., 12., 13., 14. és 20. napon vérképvizsgálatot végeztünk. Az eredményeket az alábbi táblázatban tüntetjük fel. Vérképvizsgálat Vörösvértest Fehérvérsejt napja a beoltás (millió/mm3) (ezer/mm3) után kezelt kontroll kezelt kontroll A 8,66 7,06 6,466 7,800 5. 7,2 6,95 8,732 8,466 8. 8,2 7,8 7,200 7,7 33 10. 7,2 6,4 8,520 8,900 12. 7,5 5,7 10,800 6,500 13. 6,6 4,9 8,260 6,700 14. 5,5 4,5 9,000 7,700 20. 5,0 2,1 7.133 5,100 A fenti adatokból megállapítható, hogy a TML.Glu-tal végzett kezelés jelentős mértékben 45 enyhíti az NK/Ly tumor növekedése során kialakuló súlyos fokú anaemiát. LD50-értéke egéren i.p. mérve 1500 mg/kg feletti. A továbbiakban a triciummal jelzett timidin (3H TdR) beépülését vizsgáltuk egészséges, 12-hetes 50 DBA/2 nőstény egerek thymusába, csontvelejébe, lépébe és vékonybél nyálkahártyájába, valamint in vivo proliferáló NK/Ly ascites tumorsejtekbe. Csoportonként és időpontonként 5—5 állatot használtunk, a kísérleteket négy alkalommal megismétel- 55 tűk, a TML Glu-ot 100 mg/kg dózisban adagoltuk i.p. Azt találtuk, hogy a TML.Glu 85 ± 7%-kal fokozta a thymus, 75 ± 8%-kal a lép és 94±ll%-kal az NK/Ly tumorsejtek 3HTdR beépülését a kezelést követő 24. órában. A csontvelő 60 sejtek a kezelést követő 10. és 48. órában mutattak fokozott 3HTdR beépülést, 57 ±4%-os, illetve 72 ± 5%-os növekedést. Az NK/Ly tumorsejtek esetén a 48. órában a beépülés még tovább fokozódott (124 ±14%). I.p. adagolás esetén nem fokozó- 65 dott a 3HTdR beépülése a vékonybél nyálkahártyájába, p.o. adagolás esetén azonban a kezelés után 32 órával a beépülés 50 ± 9%-os fokozódását észleltük. Ez azt mutatja, hogy a sejtek elkezdték a DNS szintézisét, aktív fázisba léptek. A lymphocyta sejtekre gyakorolt transzformáló hatást humán tenyészeten is megvizsgáltuk. Egészséges véradók peripheriás véréből Ficoll-Uromiro gradiens segítségével lymphocytákat izoláltunk, amelyeket ezután 5 x 105/ml sejtszámmal 20 °C autolog szérumot tartalmazó Parker 199 közegben szuszpendáltunk, és 96 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk őket. A minták egy részét lOOjug/ml TML.2HCl-dal, egy részét 100pg/ml TML.Glu-tal kezeltük, a további minták kontrollként szolgáltak. A transzformáló hatást a 3HTdR beépülésének mértékével határoztuk meg, a 3HTdR kezelést (11 pCi/ml) a tenyészetek leállítása előtt 3 órával végeztük. A tenyészeteket az indítás után 48, 72 és 96 órával állítottuk le. Forró perklórsawal v^zett extrahálás után folyadék szcintillációs módszerrel határoztuk meg a DNS-hez 2
