174500. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kolecisztokinin-pankreozimin oktapeptidamid -szulfátészter előállítására
3 174500 4 amidot alacsony hőmérsékleten koncentrált kénsawal, illetve kénsav-káliumhidrogénszulfát eleggyel kezelik. A kénsavas kezelés után meglehetősen rossz (10%) termeléssel nyerik ki az oktapeptidamid-szulfátésztert, s melléktermékként nagy menynyiségű szulfonált tirozint tartalmazó peptid is keletkezik. Azt találtuk, hogy a védett oktapeptidamid szulfatálása lényegesen meggyorsítható, ha piridin-kéntrioxid komplex helyett legalább egy alkilcsoportot tartalmazó tercier amin-kéntrioxid komplexet alkalmazunk valamely éter jelenlétében. Megfigyeltük azt is, hogy az irodalomban a triptofán terc-butileződésének és oxidálódásának kivédésére javasolt N'-formil-csoport [D. Yamashiro, C.H.Li: J. Org. Chem. 38, 2594 (1973)] meglepő módon a szulfátészter képzés közben lejátszódó szulfonálódástól is [A.P. Terentyev, L.A. Janovszkaja: Zs. Org. Khim. 21, 1295 (1951)] megvédi a triptofánt. A védőcsoportok acidolitikus eltávolításánál érdekes módon azt találtuk, hogy a szulfátészter-csoport ismert savas hidrolízise még hosszabb, több órás kezelés után sem következik be, ha a védett oktapeptidamid alkálifém-sóját reagáltatjuk trifluorecetsav vagy merkaptoetánszulfonsav fölöslegével. Az új termelési módszerek együttes alkalmazásával lényegesen jobb eredmények érhetők el, mint az irodalomban leírt értékek. A találmány tárgya tehát új eljárás az L-aszparagil-O-szulfáto-L-tirozil-L-metionil- glicil-L-triptofil-L-metionil-L-aszparagil-L-fenilalanin-amid és sói előállítására. A találmány szerint a kolecisztokinin-pankreozimin C-terminális oktapeptidamid-szulfátészterét és sóit úgy állítjuk elő. hogy valamely X-L-Asp-L-Tyr-L-Met-Gly-L-Trp! I Y FOR -L-Met-L-Asp-L-Phe-NH2 I W Il általános képletű védett oktapeptidamid — ahol X terc-butiloxikarbonil-, benziloxikarbonil- vagy a,a-dimetil-3,5-dimetoxi- benziloxikarbonilcsoportot, Y és W terc-butiloxi-, benziloxi- vagy hidroxilcsoportot és FOR formilcsoportot jelent — szulfátészterezését valamely éter, előnyösen dioxán vagy tetrahidrofurán jelenlétében legalább egy alkilesoportot tartalmazó tercier amin — kéntrioxid komplexszel végezzük, a kapott vegyületet alkálifém-hidroxiddal kezeljük, miközben a triptofánról a formilcsoport lehasad, ezután a többi védőcsoportot acidolízissel eltávolítjuk, kívánt esetben a kapott alkálifémsóból a szabad oktapeptidamid-szulfátésztert előnyösen ioncserével felszabadítjuk és kívánt esetben ismert módon valamely bázissal egyéb, gyógyászatilag alkalmazható sóvá alakítjuk. A szulfátészterezéshez felhasznált komplexben a legalább egy alkilcsoportot tartalmazó tercier aminok kéntrioxiddal komplex képzésre képes, telített alifás tercier amínok lehetnek, amelyekben az alkilcsoportok telített, nitrogénatomot és adott esetben további heteroatonjot, így oxigénatomot is tartalmazó, 5-10 gyűrűtagú, mono- vagy biciklusos gyűrűt is alkothatnak és a gyűrűben adott esetben hidat is képezhetnek. Ilyenek például a rövidszénláncű trialkilaminok, az N-(rövidszénláncú alkil)-morfolinok, az N-(rövidszénláncú alkil)-piperidinek, a kinuklidin és a kinolizidin. Előnyösek az 1-4 szénatomos alkilcsoportokat tartalmazó trialkilaminok, így például a trietilamin, tributilamin és diizopropiletilamin, vagy pedig az 1-4 szénatomos alkilcsoportot tartalmazó N-alkil-morfolinok, így például az N-metil-morfolin. A kiindulási anyagként használt védett oktapeptidamidot önmagában ismert módon fragmenskondenzációval vagy aminosavankénti lánchosszabbítással állítjuk elő, amikor a vegyes anhidrides, azidos, aktív észteres és diciklohexilkarbodiimides technikát használhatjuk. Alkalmazhatjuk az úgynevezett szilárd fázisú szintézist is, amikor a láncvégi karboxilcsoportjával valamely polimerrel összekapcsolt peptidet úgy építjük fel, hogy az aminosavakat a polimerhez kötött C-terminális aminosavhoz megfelelő sorrendben hozzákapcsoljuk. A reakcióban részt nem vevő funkciós csoportokat célszerűen védjük, különösen hidrolízis, acidolízis, hidrazinolízis vagy redukció útján könnyen lehasítható csoportokkal. Különösen alkalmas a triptofán indol N-jét formilcsoporttal védeni, amely a peptid felépítése közben az acidolízisek során megakadályozza a terc-butil-származékok képződését. A védőcsoportok megfelelő kombinációjával el tudjuk érni, hogy ezek önmagukban ismert módszerek szerint például hidrolízissel, acidolízissel, hidrazinolízissel vagy redukcióval szelektíven, illetve egyszerre eltávolíthatók legyenek. Az eljárás egy előnyös kiviteli módja értelmében úgy járhatunk el, hogy olyan oktapeptidamidból indulunk ki, amelynek védőcsoportjai a II általános képlet alapján X = BOC, Y = OBu*. A védett oktapeptidamidot N-metil-morfolin-kéntríoxid komplex dioxános oldatával szulfátészterezzük, majd két mólckvivalens nátriumhidroxiddal vizes oldatban nátriumsóvá alakítjuk, miközben a triptofán formil-védőcsoportját lehasítjuk, majd végül a BOC és OBu* védőcsoportot trifluorecetsav-merkaptoetanoT -víz-anizol 8 : 1 :1 : 1 elegy, illetve 3 mólos merkaptoetánszulfonsav/jégecet alkalmazásával távolijuk el. A fenti módszerrel általában egységes végterméket kapunk, ha tisztításra mégis szükség van, előnyösen szilikagéloszlopon kromatografáljuk etilacetát-(piridin-ecetsav-víz 20 : 6 :11 ) 1:1 arányú eleggyel. Az oktapeptidamid-szulfátészter előállításához szükséges védett oktapeptidamidot [BOC-Aps(OBu*) - Ty r-Met-Gly-Trp( FOR)-Met- Asp-Phe-NHj ] célszerűen a következő módon állítjuk elő. L-metionil - L-aszparagil-L-fenilalaninamidot N-terc-butiloxikarbonil-N’- formil-L-triptofán-pentaklórfenilészterrel acilezünk, a védett tetrapeptidamidról szokásos módon 1 n sósav-jégecettel eltávolítjuk az N-terc-butiloxikarbonil védőcsoportot. A szabad tetrapeptidamidot terc-butiloxikarbonil-L-metionil-glicin-pentaklórfenilészterrel acilezzük. A 5 ío 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
