174399. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ergoszterin és ubikinon-9 élesztők biolipid frakciójából történő egyidejű kinyerésére
3 174399 4 1. mindkét eljárás során a hidrolízist erélyes körülmények között végzik, mely körülmények mellett a másik céltermék, az ubikinon elkülönítése nem lehetséges. 2. A nyers ergoszterin hozama igen kicsi (27-34%) és a tiszta ergoszterin előállításához (90—95% ergoszterin-tartalommal) munkaigényes kétszeri vagy háromszori raffmáció és a raffinált termék átkristályosítása szükséges. Az ubikinon-9 előállítása ismert a bonyolult összetételű táptalajon tenyésztett Candida tropicalis Kp —233 élesztő felhasználásával is. A tenyésztéshez felhasznált táptalaj ásványi sókból, 10—13 szénatomszámű n-alkán frakciókból, aromás vegyületekből (például p-oxibenzoesav), biostimulátorokból (almasav és kukoricaextraktum), valamint detergensekből áll. [S. Shimizu, A. Tanaka, S. Fukui, J. Ferm. Tech. 48, 533 (1970)] Ennek ellenére a japán kutatók nem az ubikinon-9 előállítási eljárásának kidolgozását tűzték ki célul, hanem annak szuperszintézissel való megvalósítását. Az ubikinon-9 bioszintézise terén elért eredmények ellenére a bioszintézist magában foglaló eljárás hátrányokkal rendelkezik, mint például: 1. a folyamat reprodukálhatósága feltételezi egy extra szelekcionált, az ubikinon-9 szuperszintéziséhez alkalmas termelő mikroorganizmus felhasználását, amely azonban kis növekedési sebességgel rendelkezik. 2. Az ubikinon-9 vegyületnek a tenyésztett Candida tropicalis Kp—233-ból való szuperszintéziséhez drága táptalaj szükséges, amely aromás vegyületeket, biostimulátorokat, detergenseket és 10—13 szénatomos n-alkán frakciókat tartalmaz. 3. Az ubikinon-9-nek a reakcióelegyből való elkülönítéséhez az egész biomasszát hidrolizálni kell, ami kizárja a biomassza fehérje részének állati táplálékként történő felhasználását. Az ismertetett eljárás azonban csupán laboratóriumi eljárás, amelynek üzemi alkalmazásáról nincsenek adatok. A szakirodalom nem nyújt tájékoztatást olyan eljárásról, amely az ergoszterin és az ubikinon egyidejű előállítására utal. A találmány célja a fenti hátrányok kiküszöbölése. A céllal összhangban a találmány feladatául tűztük ki élesztő bioszintézise során keletkező termékekből az ergoszterin és ubikinon-9. előállítására eljárás kifejlesztését, amely lehetővé teszi e termékek egy technológiai lépésben történő egyidejű kinyerését. A találmány értelmében eljárást dolgoztunk ki ergoszterin és ubikinon-9 előállítására. Az eljárás során az ergoszterint és ubikinon-9-et termelő élesztőgomba biomasszájából származó biolipid-frakciót alkoholos lúggal olyan antioxidálószer jelenlétében hidrolizáljuk, amely meggátolja az ergoszterin és ubikinon-9 oxidációját, amikor is a biolipid-frakciót kicsapjuk, a hidrolizált elegyből az el nem szappanosítható komponenseket extraháljuk és az extraktumot az ergoszterin kristályok képződéséig bepároljuk. A bepárlás során keletkező ergoszterint az anyalúgból leválasztjuk és eltávolítjuk az anyalúgból az extrahálószer maradékát, majd az olajos terméket, amely az extrahálószer eltávolítása és az ergoszterin egyidejű kicsapása után visszamaradt, adszorbciós kromatográfiának vetjük alá. „Biolipid-frakció” kifejezés alatt olyan frakciót értünk, amelyet különböző ergoszterin és ubikinon-9 termelésére képes élesztőgombák biomasszájából választunk le, oly módon, hogy a száraz biomasszát 80 °C hőmérsékleten petroléterrel vagy hexánnal kezeljük, aholis a biomassza és az extrahálószer térfogataránya 1:5 és 1:8 közötti, majd az extraktumot szüljük és az extrahálószert vákuumban lepároljuk. Az így visszamaradó anyag a biolipid-frakció. Amennyiben a biolipid-frakciót a nyers biomasszából állítjuk elő, úgy a zsíroldható alkotórészek extrahálásához acetont alkalmazunk. A biolipid-frakciók hidrolíziséhez rövidszénláncú alifás alkanolokat, előnyösen metilalkoholt alkalmazunk, hogy az ubikinon-9 molekulájában a metoxicsoportnak alkoxi-csoportokkal való esetleges nukleofil szubsztitúcióját megakadályozzuk. Az alkoholos lúggal végzett hidrolízishez előnyösen káliumhidroxidot alkalmazunk, mivel ennek felhasználásával kedvezőbb hidrolízis körülményt biztosíthatunk. A káliumhidroxid koncentrációja 8—12% lehet. A káliumhidroxid koncentráció e határon túl való növelése a céltermékek mennyiségének csökkenését vonja magával. A találmány értelmében a hidrolízishez antioxidálószerként különböző anyagokat használhatunk, amelyek az ergoszterin és az ubikinon-9 oxidációját meggátolják. Antioxidálószerként alkalmasak például pirogallol, szantokin, butiloxitoluol és egyéb antioxidáns. Az antioxidálószer mennyisége különböző lehet. A választott mennyiséget az antioxidálószer jellege határozza meg, például pirogallol esetén a biolipid-frakció súlyára vonatkoztatva 1— 3%-ot alkalmazunk. Ajánlatos a hidrolízist a reakcióelegy fonáspontján végezni 30-45 percen át. Ez az időtartam elegendő, hogy a célterméket a lehető legnagyobb hozammal állítsuk elő. A találmány értelmében a hidrolizált elegyet az el nem szappanosítható komponensek kicsapása céljából extraháljuk. Extrahálószerként ismert és könnyen hozzáférhető szerves oldószerek alkalmazhatók, amelyek közömbösek az ergoszterin és az ubikinon-9-el szemben, mint például n-hexán, petroléter, dietiléter, benzol stb. Előnyös a dietiléter alkalmazása, mivel az extrakció során csupán kissé tartós emulziót képez. Az eljárás során kapott extraktumot az ergoszterin kristályok képződéséig bepároljuk, amelyeket azután az anyalúgtól elválasztunk. Az extrahálószer maradékát az extraktumból eltávolítva olajos terméket kapunk, amelyet például alumíniumoxiddal töltött kolonnán adszorbciós kromatográfiának vetünk alá. Az alábbiakban részletesen ismertetjük az eljárás kivitelezését: 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 S5 2
