174315. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nagytisztaságú,aminoglükozid-tipusú antibiotikumok elkülönítésére
9 174315 10 3. példa Az 1. példa szerint a Wofatit gyantaoszlop eluálásánál kapott, 4 és 5’ faktorokat tartalmazó 8-13. frakciókból visszamaradt 30 liter oldatot vákuumban fele térfogatra pároljuk, majd az elegyhez 2500 g légszáraz, hidroxil-formában levő Dowex—1 X—2 (50—lOOmesh) ioncserélő gyantát adunk, és az elegyet 5 óra hosszat 95-98 °C között hőkezeljük. Az elegyet szobahőfokra hú'tjük, és az ioncserélő gyantát kiszűrjük, majd a kapott oldatot vákuumban 2 liter térfogatra pároljuk be, és ezt az oldatot 6,5 liter Amberlite CG—50 II (ammónium-formájú) gyantát tartalmazó oszlopra (oszlop-átmérő: 9 cm, rétegmagasság: 102 cm) visszük. Az oszlopot 10 liter ion-mentes vízzel átmossuk, majd a hatóanyagot sorrendben 25 liter 0,12 n, 35 liter 0,15 n, 35 liter 0,20 n és 30 liter 0,30 n vizes ammóniumhidroxid oldattal eluáljuk. 5 liter/óra sebességgel. 5-5 literes frakciókat szedve az alábbi összetételű frakciókat kapjuk: Frakció- összetétel -szám Súly (grammban) 1—8. szennyezések 31 9-11. szennyezések + 5-ös faktor 14 12—18. 5-ös faktor 112 19. 5 + 6-os faktor 3 20-24. 6-os faktor 97 Az első példában leírtakkal azonos módon eljárva, 112 g kanendomicin, illetve 97 g tobramicin bázist kapunk. 4. példa 4106 liter térfogatú, 1100mcg/ml hatóanyagtartalmú erjesztéses oldat pH-ját keverés közben telített oxálsav oldattal 2,0 értékre állítjuk, térfogatára számított 3%-nyi perlitet (P3) adunk hozzá, majd keverés után leszűrjük. A szűrés után kapott 3090 liter, 1220 mcg/ml hatóanyagtartalmú savanyú oldat pH-ját keverés közben 25%-os ammónium-hidroxiddai 7,5 értékre állítjuk, majd a savanyú lé térfogatára számított 1%-nyi perlitet adunk hozzá és keverés után leszűrjük. A semleges szűrt oldatot 100 liter/óra sebességgel egy 200 mm átmérőjű, 2000 mm magas oszlopán levő 45 liter térfogatú (1 :7 arány) NHÎ formába hozott Varion KCO kationcserélő gyantára vezetjük, lebegő-ágyban. A gyanta a szűrtlében levő nebramicin komplexet megköti. Az elmenő lé hatóanyagtartalma 15 mcg/ml. A megkötés befejezése után a gyantaágyat lebegő-ágyban vízzel addig mossuk, míg az elmenő mosóié színtelen nem lesz. Ezután a megkötött antibiotikumokat 0,2-0,5 n ammónium-hidroxid oldattal direkt-ágyban 15 liter/óra sebességgel eluáljuk. Az eluátumot 5 ízben 10 literes, majd 30 literes frakciókban szedjük és vékonyrétegkromatográfiásan vizsgáljuk. A frakciók 5 vékonyrétegkromatográfiás vizsgálata alapján „A” és „B” frakciót különítünk el. Az „A” frakció, amelynek térfogata körülbelül 10 liter, fő tömegében apramicint tartalmaz, míg a „B” frakció — 120 liter — minimális apramicin tartalom mellett 10 főleg karbamoil-kanamicin B-t és karbamoil-tobramicint tartalmaz. Az „A” frakciót, valamint a hidrolizátum oszlopkromatografálása után kapott, zömében apramicint tartalmazó frakciókat egyesítjük, vákuumban 15 olajsűrűségűre bepároljuk. 10 n kénsavval pH 4,0-re savanyítjuk, majd a bepárolt oldat térfogatára számított tízszeres mennyiségű metanolban keverés mellett kicsapjuk a nyers apramicin-szulfátot. 1 órán át állni hagyjuk, majd a kiülepedett termé- 20 két szűrjük, s a kicsapó metanol mennyiségének 5—10%-ával mossuk. 60 °C-on 24 óráig vákuumban szárítjuk. Kinyert nyers apramicin-szulfát: 1735 g/m3 savanyú szürtlé, 1355g/m3 fermentlé. Biológiai hatóértéke (tobramicin-szulfáthoz mér- 25 ve): 32%. A „B” frakcióhoz tartozó eluátumokat egyesítjük, vákuumgyorsbepárló készüléken 1/30-ad részre besűrítjük és 150 g nátrium-hidroxiddal 3,5 órán keresztül forralva hidrolizáljuk, s így kanamicin B-t 30 és tobramicint kapunk. Hidrolízis után a szobahőmérsékletre hűtött oldat pH-ját 25%-os sósavval 8,0-ra állítjuk. A hidrolizátumot 15 liter/óra sebességgé' egy 200 mm átmérőjű, 2000 mm magas oszlopban levő 55 liter térfogatú (1 .9 arány) Nlf, 35 formában levő Amberlite CG—50 I. kationcserélő gyantára vezetjük direkt-ágyban, majd vízzel addig mossuk, míg az elmenő mosóié színtelen és klorid-mentes (ezüstnitrátos ellenőrzés) nem lesz. Az eluálás sebessége 15 liter/óra, az eluáló oldatok 40 mennyisége 60—60 liter 0,100, 0,125, 0,150, 0,175, 0,200, 0,250, 0,300 n ammónium-hidroxid. Frakciószedés: 0,100-0,150 n között 5 literenként (100 liter), 0,175-0,300 n között 2 literenként (120 liter). Az eluálás menetét kénsavas metanollal 45 ellenőrizzük, az 5 literes frakciók szedését akkor kezdjük meg, amikor az eluátum a kénsavas metanollal csapadékot ad. Az egyes frakciók vékonyrétegkromatográfiás vizsgálata alapján a zömében apramicint tartalmazó frakciókat (kb. 50 liter) 50 az ioncserénél félretett „A” frakcióval egyesítjük. A kanamicin B-t tartalmazó frakciókat vákuumban 25-30%-os szárazanyagtartalomig (refraktomé terrel mérve) bepároljuk. Az oldatot 10 n kénsawal pH 2,0-re savanyítjuk, majd dietil-aminnal a pH-t 55 5,5-re állítjuk be. A várlátó hatóanyagtartalomra számított 10%-nyi mennyiségű aktívszénnel 30 percig keverjük, majd szűrjük az oldatot. Térfogatra számított tizenkétszeres mennyiségű metanolba öntve kicsapjuk a kanamicin-B-szulfátot. 1 órán át 60 állni hagyjuk, majd a kiülepedett anyagot kiszűrjük. A kicsapó metanol mennyiségének 5-10%-ával mossuk és 60 °C-on vákuumban 24 óráig szárítjuk. A kinyert kanamicin-B-szulfát mennyisége a következő: 155,5 g/m3 savanyú szürtlé, 121,0 g/m3 fer- 65 mentié. Biológiai aktivitás (tobramicin-szulfáthoz 5
