174315. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nagytisztaságú,aminoglükozid-tipusú antibiotikumok elkülönítésére
7 174315 8 három gyógyászatilag igen jelentős antibiotikum előállítását. Az eljárás nagyüzemileg kiválóan alkalmazható, egyszerű lépésekből áll és kitermelés tekintetűjén 40-50%-kal felülmúlja az eddig ismert módszereket. Az eljárás további előnye, hogy a korábban ismert eljárásokkal szemben már az első lépésben megoldja a további átalakítást igénylő 4 és 5* faktoroknak az apramicintől történő elválasztását. Ezenkívül nincs szükség a nyers nebramicin-komplex-szulfát előállítására, továbbá Dowex— 1X1 gyantán történő újbóli kromatográfiás tisztítására sem. Eljárásunknál az ammóniumhidroxidos eluátumfrakciók kismértékű betöményítés után vagy e nélkül is, közvetlenül tovább dolgozhatók fel, így az eljárás a fermentléből a végtermékig folyamatosan vihető végbe. Előnyös az is, hogy a találmány szerinti eljárás segítségével a műveleti lépéseket követően, közvetlenül gyógyászatilag felhasználható tisztaságú végtermékek állíthatók elő. A találmány szerinti eljárást az alábbi kiviteli példákkal részletesen ismertetjük. 1. példa A Streptomyces tenebrarius ATCC 17920 sz. törzs 1000 liter erjesztéses oldatát (amelyet a 3 691 279 sz. Amerikai Egyesült Allamok-beli szabadalmi leírás 1. példája szerint áhítottunk elő) oxálsav-adagolással pH = 2,0-re állítjuk be. Az így kapott elegyet 30 percig keverjük, majd szűrjük, és a kiszűrt csapadékot 150 liter vízzel átmossuk. Ily módon 1085 liter oldatot kapunk, amely 550 mcg/ml 2-es, 335 mcg/ml 4-es és 280 mcg/ml 5’-ös faktort tartalmaz. Az oldat pH-ját 25%-os ammóniumhidroxiddal 7,5-re állítjuk be, és ezt az oldatot 2 db sorbakapcsolt, egyenként 10-10 liter ammónium-formában levő Wofatit CP-300 ioncserélő gyantát tartalmazó oszlopon (oszlop-átmérő 12 cm, gyanta rétegmagasság 88 cm) folyatjuk át 50 liter/óra sebességgel. Az átfolyatás befejezése után az első oszlop teljesen telítődik antibiotikumokkal, míg a második oszlop effluense biológiailag gyakorlatilag inaktív. Az első gyantaágyat ezután ionmentes vízzel kimossuk, és 80 liter 0,15 n, majd ezt követően 50 liter 1,0 n ammóniumhidroxiddal oldjuk le 5 lit ./óra sebességgel. 10-literes eluátum frakciókat szedve a következő összetételű frakciókat kapjuk: Frakció-szám összetétel Súly (grammban) 1-2. szennyezések 150 3-6. 2-es faktor 431 7. 2 ♦ 4-es faktor 112 8. (2*y 4 + 5’-ös faktor 78 9-12. 4 ♦ 5’-ös faktor 405 13. 5*-ös faktor 22 A 8-13-as frakciókat egyesítjük, és az így kapott 60 liter oldatból 30 litert vákuumban 70 °C-on 7,5 liter térfogatra bepároljuk, majd az oldathoz 40 g nátriumhidroxidot adunk, és az elegyet 2 órán keresztül 98—100°C-on tartjuk. Az így kapott elegyet vákuumban 2 liter térfogatra pároljuk be, szobahőfokra hűtjük, majd pH-ját 5 n sósavval 9,0-ra állítjuk be. Az oldathoz 15 g aktívszenet adunk, és 30 perc keverés után leszűrjük. A szűrt oldatot 8 liter Amberlite CG—50—II (ammónium-forma) gyantát tartalmazó oszlopra (010 cm, rétegmagasság 102 cm) visszük, és az oszlopot 18 liter ionmentes vízzel átmossuk, majd a hatóanyagokat sorrendben 25 liter 0,12 n, 40 liter 0,15 n, 40 liter 0,20 n és 15 liter 0,30 n vizes ammóniumhidroxid-oldattal eluáljuk 5 liter/óra sebességgel. 5—5 literes frakciókat szedve az alábbi összetételű frakciókat kapjuk: Frakció-szám összetétel Súly (grammban) 1-10. szennyezések 52 11-12. szennyezések + 5-ös faktor 16 13-17. 5-ös faktor 104 18. 5 + 6-os faktor 5 19-23. 6-os faktor 93 A 13—17-es frakciókat egyesítés után vákuumban szárazra pároljuk be, majd benzol-etanol eleggyel vízmentesítjük. Ily módon 104 g 99% tisztaságú kanendomicin bázist kapunk. A 19-23-as frakciókból hasonló úton 93 g tobramicin bázist kapunk, mely 1%-nál kevesebb idegen anyagot tartalmaz. 2. példa Az 1. példa szerint a Wofatit gyantaoszlop eluálásánál kapott 2-es faktort tartalmazó 3—6. frakciókat vákuumban 3 liter térfogatra bepároljuk, majd 50 g aktívszénnel derítjük, és a szénről leszűrt oldathoz 50 °C-on annyi etanolt adunk, hogy a kezdődő zavarosság még megmaradjon. Ehhez 18 liter abszolút etanol szükséges. Az elegyet +4 °C-on 24 óráig állni hagyjuk, majd a kivált 95% tisztaságú apramicint kiszűrjük, és vákuumban súlyállandóságig szárítjuk. Ily módon 253 g 95% tisztaságú apramicin bázist kapunk. A leszűrt anyalúgot vákuumban 3 liter térfogatra pároljuk be, majd a bepárlás során kivált további apramicin bázist +4 °C-ra történő lehűtés után ugyancsak kiszűrjük. Ily módon 178 g 98% tisztaságú apramicin bázist kapunk. A kapott két apramicin bázist egyesítjük, és 80%-os vizes alkoholból átkristályosítva 386 g 99% tisztaságú apramicin bázist kapunk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
