174315. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nagytisztaságú,aminoglükozid-tipusú antibiotikumok elkülönítésére
5 174315 6 újabb kromatográfiával tiszta apramicint állíthatunk elő. A karbamoil-csoportok lehasítására (a 4 és 5* komponensek átalakítása kanendomicinné, illetve tobramicinné) különösen előnyös a hidroxil-formájú, erősen bázisos anioncserélő gyanták alkalmazása. -Így további hamuképző szennyezőanyagok bevitele nélkül oldható meg a karbamoil-csoportok eltávolítása. Ennek az átalakításnak az elvégzése azzal az előnnyel jár, hogy a további szétválasztást a 4 és 5’ komponensek már nem zavarják, szemben a korábban ismert módszerekkel, melyek ezáltal a tiszta 5 komponens előállítására nem adtak lehetőséget. A kanendomicin és tobramicin elválasztásánál alkalmazott (második ioncserélős lépés) finomszemcsés karboxil-típusú gyanta és az illékony ammonium bázisok segítségével végzett lépcsőzetes grádiens elúciós kromatográfia lehetővé teszi, hogy viszonylag igen kis oldószertérfogatok felhasználásával az erősen szennyezett, magas hamu-tartalmú kiindulási termékekből is igen nagytisztaságú, minden szerves és szervetlen szennyezéstől mentes végterméket állítsunk elő a megfelelő eluátum frakciók egyszerű betöményítésével. Az így kapott termékek elemzési adatai a következők: apramicin: elemi analízis: C =46,18%, H =7,95%, N =12,83%, számított: C =46,75%, H =7,66%, N = 12,98%, (a)fj° = +164° (1%, víz), hamu 0,0%, kanendomicin: elemi analízis: C =43,82%, H =7,92%, N =13,87%, számított: C =43,11%, H=7,84%. N =13,96%, («)d° = +133° (1%, víz), hamu: 0,0%, tobramicin: elemi analízis: C =44,30%, H =7,90%, N = 14,28%, számított: C =44,52%, H=8,10%, N = 14,43%, (ú)d° = +130° (1%, víz), hamu: 0,0%. Valamennyi termék 1%-nál kevesebb idegen anyagot tartalmaz. A tiszta apramicin előállítását az első ioncserélős elválasztási lépésnél kapott 0,05—0,2 n ammóniumhidroxidos eluátum frakció betöményítése után közvetlen kristályosítással is megoldhatjuk, de alkalmazhatunk erősen bázisos anioncserélő gyantákon (Dowex—1X1) ionmentes víz vagy karboxil-típusú kationcserélő gyantákon (Amberlite CG-50) ammóniumhidroxid segítségével végzett kromatográfiás tisztítást is. Vizes oldatokból, melyek lehetnek leszűrt erjesztéses oldatok vagy bármilyen más, apramicint és/vagy nebramicin-4-et és/vagy nebramicin-5’-t tartalmazó vizes oldatok, úgy állítunk elő apramicint, kanendomicint és tobramicint, hogy a vizes oldato* egy kation-formában, előnyösen ammónium-formában levő karboxil-típusú ioncserélő gyantát tartalmazó oszloprendszeren folyatjuk át 4— 10-es, célszerűen 7—8-as pH-n oly módon, hogy az egyes gyantaágyak teljesen telítődjenek, vagyis a megkötés befejezése után a gyantaágyon átfolyó oldat hatóanyag-tartalma már megegyezzen a gyantaágyra felvitt oldat hatóanyag-tartalmával. Ezután az apramicint a gyantáról 0,05—0,2 n, célszerűen 0,15 n vizes ammóniumhidroxid oldattal oldjuk le, ezt követően a nebramidn-4-et és 5’-t 0,2—4,0 n, célszerűen 1,0 n ammóniumhidroxiddal oldjuk le. A kapott apramicint tartalmazó eluátum-frakcióból a vizet elpárologtatjuk, és a nyers apramicint ily módon kinyerjük, majd vizes alkoholból átkristályosítjuk. A nebramicin-4-et és -5’-t tartalmazó eluátumból ezután a víz túlnyomó részét bepárlással eltávolítjuk, és az 5—10% szárazanyag-tartalmú vizes oldat pH-ját valamely nem illékony erős bázissal legalább 12-re, célszerűen 14-re állítjuk be, és/vagy az oldathoz hidroxil-formában levő, erősen bázisos anioncserélő gyantát adunk, és az elegyet 0,5—24 órán keresztül, célszerűen 3 órán át hőkezeljük. A hidrolízishez alkalmazott bázis súlya előnyösen az elegyben levő hatóanyagok súlyának mintegy 1/4 része. A hőkezelés során keletkezett vizes oldat pH-ját 5—11-re, célszerűen 7-9-re állítjuk be, és a kapott oldatot aktívszénnel derítjük. Amennyiben az átalakításhoz csak ioncserélő gyantát alkalmaztunk, ezek a lépések elmaradnak. Az így kapott oldatokat ezután ammónium-formában levő finomszemcsés, karboxil-típusú kationcserélő gyantán megkötjük, majd a gyantaágyat vízzel mosva a szervetlen sókat és a pigmenteket eltávoljuk. A hatóanyagokat a gyantaágyról 0,1-1,0-ig növekvő koncentrációjú ammóniumhidroxid-oldatokkal oldjuk le maximálisan 100 ml/cm2/óra, célszerűen 20—40 ml/cm2/óra sebességgel. A 0,1 —0,15 n ammóniumhidroxiddal végzett első leoldáskor csekély mennyiségű apramicin, majd további kisebb mennyiségű, biológiailag hatékony és hatástalan anyagcseretermékek oldódnak le, majd a 0,2—0,25 n ammóniumhidroxid-koncentrációnál a kanendomicin, ezt követően a 0,3—0,35 n ammóniumhidroxid-koncentrációnál jól elkülönülve a tobramicin oldódik le a gyantaágyról, nagyobb ammóniumhidroxid-töménységnél neamin, illetve nebramin oldható le. A leoldás befejezése után a tiszta elkülönített komponenseket tartalmazó frakciókból vizet, illetve az ammónium-bázist vákuum bepárlással, porlasztva szárítással vagy liofllezéssel eltávolítjuk, és így szabad bázis formájában jutunk a tiszta hatóanyagokhoz. Az anyagokat ezután számított mennyiségű vizes ásványi savban oldva a megfelelő sóvá, például szulfáttá alakíthatjuk át, és a kapott oldatból betöményítés után valamely vízzel elegyedő szerves oldószerrel, í%y például metanollal, etanollal vagy acetonnal csaphatjuk le a megfelelő szulfátsókat. A találmány szerinti eljárás legfőbb előnye, hogy a fermentációval kapott több komponenst tartalmazó eijesztéses oldatból igen egyszerű módon, kitűnő (75-85%-os) hozammal oldja meg 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
