174315. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nagytisztaságú,aminoglükozid-tipusú antibiotikumok elkülönítésére
3 174315 4 0,1 n ammóniumhidroxiddal eluálják. így részlegesen elválasztott nebramicin-2, -4, -5, illetve -6 faktorokat kapnak. A termék végső tisztítását úgy végzik, hogy heliantát-sót képeznek, ezt kénsavval megbontják, majd Dowex 1X2 (OH) és ezt követően Biorad AG11A8 gyantán a bázis oldatát kromatografálják -s végül liofílezik. Nem kevésbé nehézkes a 3 691 279 sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban szereplő eljárás, mely szerint a nebra micin komplexet a leszűrt erjesztéses oldatból nátriumdodecilszulfoacetáttal (Lathanoi) csapják ki, melyet szűrnek és acetonnal mosnak, majd az így kapott komplex sót Biorex-70 gyantán grádiens elúciós kromatográfiával nebramicin-2, -4 és -5’ faktorokra választják szét. Ily módon nincs közvetlen lehetőség a kanendomicin és tobramicin előállítására, hanem ezeket utólag kell előállítani a 4 és 5’ faktorokból. A kanendomicin előállítását az 1 244 042 sz. Nagy-Britannia-i szabadalmi leírás szerint egy Streptomyces kanamyceticus mutáns erjesztéses oldatából végzik, a nagy feleslegben jelenlevő kanamidn-A-tól történő bonyolult kromatográfiás elválasztás útján. összefoglalva megállapítható, hogy az eddig ismert eljárások hosszadalmasak, nagy térfogatú vizes oldatok bepárlását, valamint tűzveszélyes szerves oldószeres (aceton) kicsapást és szűrést igényelnek, vagy nehezen hozzáférhető és drága vegyszerekkel történő kicsapásokat alkalmaznak. A teljesen tiszta végtermék előállításához pedig a háromszori ioncserélős lépésen túl további kromatográfiás tisztítási lépéseket vagy festéksón keresztül végzett nehézkes tisztítást tesznek szükségessé. A nebramicin eljárások során kapott termékek túlnyomó részét, illetve csaknem teljes mennyiségét a nebramicin-4 és -5’ teszi ki, melyeket utólag kell a gyógyászatban alkalmazott megfelelő végtermékké átalakítani. A nebramicin antibiotikumok végső elválasztásánál a teljes antibiotikum elegyet kromatografálják, mely igen nagy fajlagos gyanta felhasználással jár. Nagymértékben rontja az elválasztás hatásfokát az is, hogy 4-5 komponensű elegyet kell szétválasztani. A találmány célja olyan egyszerű és gazdaságos eljárás kidolgozása, mely a megfelelő mikroorganizmus erjesztéses oldatából vagy bármely más, a nebramicin antibiotikumokat tartalmazó vizes oldatból egyszerű módon teszi lehetővé a kívánt végtermék (2, 5 és 6 faktorok) előállítását és egymástól történő elválasztását. Vizsgálataink során azt találtuk, hogy nebramicin antibiotikumokat tartalmazó vizes oldatokban például egy nebramicin komplexet termelő mikroorganizmus erjesztéses oldatában található antibiotikum-elegy ioncserélő lépések különleges kombinációjával igen egyszerű módon a közbenső termékek elkülönítése nélkül alkotórészeire bontható, illetve a nemkívánatos karbamoil-származékok feldolgozás közben végzett átalakításával a gyógyászatiig értékes végtermékek, nevezetesen az apramicin (nebramicin-2), a kanendomicin (nebramicin-5) és a tobramicin (nebramicin-6) nagytisztaságú állapotban egyszerűen előállíthatok. A fentiek alapján a találmány tárgya eljárás apramicin, kanendomicin, tobramicin és sói előállítására vizes oldatokból karboxil-típusú kationcserélő gyantán történő megkötése, majd ammóniumhidroxid vizes oldatával való leoldása, majd az antibiotikum-bázisok savakkal végzett reakciója útján, amely abban áll, hogy az ammónium-formájú, karboxil-típusú kationcserélő gyantán megkötött hatóanyagok közül az apramicint 0,02—0,2 n illékony ammónium-bázis, célszerűen ammóniumhidroxid vizes oldatával leoldjuk, majd ezt követően a kanendomicin és tobramicin elővegyületét képező nebramicin-4-et és -5’-t 0,2-4,0 n, célszerűen 1,0 n ammóniumhidroxiddal oldjuk le, majd a nebramicin-4 és -5’ elegy ét valamely nem illékony erős bázissal, célszerűen nátrium- vagy káliumhidroxiddal, vagy hidroxil-formában levő, erősen bázisos anioncserélő gyantával 25—106 °C-on, célszerűen 90—98 °C-on legalább 30 percen keresztül, célszerűen 2 órán át hőkezeljük, a keletkezett kanendomicint és tobramicint 5—11-es pH-n, célszerűen 7—9-es pH-n finomszemcsés, célszerűen 200—400 mesh szemcseméretű, ammónium-formában levő, karboxil-típusú ioncserélő gyantán megkötjük, majd 0,05-től l,0n-ig növekvő töménységű, célszerűen 0,2-től 0,35-ig növekvő töménységű illékony ammónium-bázis, célszerűen ammóniumhidroxíd vizes oldatával eluáljuk, majd az elválasztott, tiszta antibiotikumot tartalmazó frakciókból a vizet eltávolítjuk, majd az előállított antibiotikum-bázisokból kívánt esetben savakkal, célszerűen kénsavval sókat képezünk. A találmány szerinti eljárás egy előnyös foganatosítási módja szerint az első lépésben az erjesztéses oldatot, mely apramicint, nebramicin-4-et és -5’-t tartalmaz főkomponensként, a kétértékű kationok eltávolítása céljából a szűrés előtt 0,1 súly% oxálsawal kezeljük, majd a szűrletet semleges pH-n ammónium-formában levő karboxil-típusú kationcserélő gyantán (Wofatit CP—300) kötjük meg. Ezután az apramicint a gyantáról híg (0,10—0,2 n), és 4 és 5* faktorokat pedig ezt követően töményebb (1,0 n) ammóniumhidroxid-oldattal oldjuk le. A 4 és 5’ komponensek elegyéből álló eluátum-frakcióhoz ezután nem illékony erős bázist (nátriumhidroxid) vagy erősen bázisos hidroxil-formában levő anioncserélő gyantát (Dowex—1X1, Amberlite—IRA—400) adunk, és az elegyet 1-3 órán keresztül 90-100°-on melegítjük. Az így kapott elegy — mely a karbamoil-csoportok kvantitatív lehasítása után kanendomicint és tobramicint tartalmaz — komponenseit finomszemcsés karboxil-típusú kationcserélő gyantán (Amberlite CG-50) híg vizes ammónium-bázisok (ammóniumhidroxid) fokozatosan növekvő töménységű vizes oldatával végzett kromatográfiával választjuk szét. Ily módon a tiszta kanendomicint, valamint a tobramicint tartalmazó frakciók szárazra párolásával nagytisztaságú anyagokat kapunk szabad bázis formájában, melyek egyszerű módon megfelelő sóvá (szulfáttá) alakíthatók át, és semmiféle további tisztítási lépést nem igényelnek. A 0,10—0,2 n ammóniumhidroxiddal kapott eluátumfrakciókból egyszerű kristályosítással vagy 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
