174263. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szerin proteázok meghatározására, valamint a meghatározáshoz használható kromogén enzim-szubsztrátok előállítására
9 174263 10 útján képződik, 380 nm-nél mutat abszorpciós maximumot, moláris extinkciós koefficiense 13 200, amely mindössze 9620-ra csökken 405 nm-nél. így lehetséges, hogy 405 mm-nél végzett spektrofotometriás méréssel könnyen követhetjük az enzimatikus hidrolízis előrehaladását, ami arányos a képződött p-nitroanilin mennyiségével. A szubsztrát fölöslege nem befolyásolja a mérés eredményét az említett hullámhossznál. Hasonló a helyzet a találmány szerinti eljárással előállítható többi szubsztrátnál is, amelyek mindegyikénél 405 nm-nél folytatott spektrofotometriás méréssel követtük a reakció előrehaladását. Az I. táblázatban összehasonlítjuk különféle szerin proteáz típusú enzimek (E. C. 3. 4. 21) és a fent említett S—2160 szubsztrát, illetve az 1. példában ismertetett szubsztrát közötti reakciók sebességét. A reakciósebességet a fent ismertetett módszerrel határoztuk meg. I. Táblázat Koncent- Szubsztrát Relatív ráció reakciósebesség Trom- v Trip- Plaz, • Xa ■ bm szm nun 0,1 mmól S—2160 100 1 100 100 0,25 mmól 1. példa szerinti vegyület 2 100 500 75 Amint a táblázatból kitűnik, az Xa faktor százszor jobban hasítja az 1. példa szerinti vegyúletet, mint az S—2160 szubsztrátot. A trombin jelentéktelen mértékben reagál az 1. példa szerinti vegyü- 5 lettel az S—2160 szubsztráthoz viszonyítva. A táblázatból az is kitűnik, hogy az 1. példa szerinti vegyúlet az Xa faktor számára a legjobb szubsztrát. Az 1. példa szerinti vegyület jó szubsztrátja a tripszinnek is. Ez a pozitív tripszin-effektus azon- 10 ban nem zavarja az Xa faktor meghatározását, mert tripszín általában nincs a vérben. 3—26. példa 15 Az 1. és 2. példában leírt eljárással előállítjuk a II. táblázatban bemutatott vegyúleteket. A termékeket a vékonyréteg-kromatogram alapján, a klórtartalom titrálás útján való meghatározásával és ami- 20 nosav-analízissel azonosítjuk, illetve tisztaságukat e módszerekkel ellenőrizzük. A kapott értékek 5%-nál kisebb mértékben térnek el a számított értékektől. A táblázatban közöljük a vegyületek [a]p4 értékeit (c = 0,5, 50%-os ecet sav) valamint a 25 Merck cég Kieselgel 60 F254 elnevezésű vékonyrétegkromatográfiás lemezén 3:1 :1 arányú butanol-ecetsav-víz eleggyel készített vékonyrétegkromatogramon talált Rf értékeit. 30 II. Táblázat A példa száma Szubsztrát (hidroklorid) [<*1d Rf 3. Bz-Leu-Glu-Gly-Arg-pNA-35 0,52 4. Bz-Val-Glu-Gly-Arg-pNA-43 0,48 5. Bz-Pro-Glu-Gly-Arg-pNA-77 0,40 6. Bz-Gly-Glu-Gly-Arg-pNA-17 0,42 7. Bz-Phe-Glu-Gly-Arg-pNA-45 0,52 8. Bz-Tyr-Glu-Gly-Arg-pNA-43 0,53 9. Ac-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA-37 0,40 10. H-IIe-Glu-Gly-Arg-pNA-35 0,32 11. H-Pro -Glu-Gly-Arg-pNA-61 0,20 12. H-Gly-Glu-Gly-Arg-pNA-50 0,26 13. H-Phe-Glu-Gly-Arg-pNA-38 0,38 14. Bz-Ile-Gln-Gly-Arg-pNA-40 0,42 15. Bz-Ile-Asp-Gly-Arg-pNA-53 0,50 16. Bz-Ile-Asn-Gly-Arg-pNA-36 0,42 5
