174263. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szerin proteázok meghatározására, valamint a meghatározáshoz használható kromogén enzim-szubsztrátok előállítására
3 174263 4 optikailag aktív csoport L-konfigurációjú, igen nagy érzékenységet mutatnak az Xa faktorral szemben. Ezeket az új vegyületeket a találmány szerint kétféle módon állíthatjuk elő. Az egyik eljárásváltozat szerint az arginint egy R2— NH2 általános képletű vegyülettel, ahol R2 jelentése a fenti, reagáltatjuk, és így az R2 kromofór csoportot az argininhez kapcsoljuk, ezután lépésről lépésre felépítjük a kívánt peptid-szerkezetet a még hátralevő aminosav-részek egymásutáni kondenzációjával. A kromofór csoport ekkor tulajdonképpen az első aminosavrész karboxil-csoportjának C-terminális védőcsoportja. A másik eljárásváltozat szerint a megfelelő, adott esetben szokásos védőcsoportokat tartalmazó aminosavakat, karbonsavakat, illetve peptid-fragmenseket a helyes sorrendben, önmagában ismert módon összekapcsoljuk egymással, ezután a védőcsoportokat eltávolítjuk, és a kapott peptid-molekulát egy R2 -NH2 általános képletű vegyülettel, ahol R2 jelentése a fenti, reagáltatjuk. A peptid-szerkezet lépésenként való felépítése során mindkét eljárásváltozatban lehetőség van arra, hogy megfelelő tisztítást végezzünk gélszűressel minden egyes újabb aminosav-rész kondenzációja után. A lépésről lépésre folytatott peptid-szintézis során a peptid-kémiában általánosan ismert és használt kapcsolási módszereket alkalmazzuk. Amino-védőcso portként a peptid-kémiában általánosan használt védőcsoportokat, így a Cbo(benziloxikarbonil-csoport), a Meo-Cbo(p-metoxibenziloxikarbonil-csoport), a N02Cbo(p-nitrobenziloxikarbonil-csoport), MCbo(p-metoxifenilazo-benziloxikarbonil-csoport), a BOC(terc-butiloxi-karbonil), a TFA(trifluoracetil) vagy a formilcsoportot használjuk. Az a-karboxil-csoportot úgy aktiválhatjuk, hogy különféle, a peptid-kémiában ismeretes és általánosan használt aktivált származékká, így például p-nitrofenilészterré, triklórfenilészterré, pentaklórfenilészterré, N-hidroxi-szukcinimid-észterré, savaziddá vagy szimmetrikus vagy aszimmetrikus savanhidriddé alakítjuk, amelyet elkülöníthetünk vagy in situ alakíthatunk ki. Az a-karboxil-csoportot aktiválhatjuk egy karbodiimiddel, mint például N,N-diciklohexil-karbodiimiddel is. Az aminopeptid-származék C-terminális karboxil-csoportját vagy az aminosav -származékot észterezéssel védhetjük meg, így például metil-, etil- vagy izopropilészterré alakítjuk a vegyületet, de átalakíthatjuk valamilyen kromofór anilin-származékká is, mely utóbbi vegyületek védőcsoportjai a peptid-szerkezet felépítése közben a peptid-lánc védelmére szolgálnak. Azokat a szabad funkciós csoportokat, amelyek nem vesznek részt a reakcióban, a peptidek vagy peptid-származékok szintézise közben az alább részletezett módon védhetjük meg. A megmaradó arginil-delta-guanidino-csoport védelmére valamilyen, a peptid-kémiában használatos amino-védőcsoportot használunk. E csoportot megvédhetjük tehát a protonizálással, nitro- vagy p-toluolszulfonil-csoporttal. A glutaminsav és az aszparaginsav karboxil-csoportjainak védelmére ugyancsak a peptid-kémiában használatos védőcsoportokat, így benzil-csoportot vagy terc-butil-csoportot használunk. E vegyületekkel oly módon végezzük a szerin proteázok, különösen az Xa faktor meghatározását, hogy a vizsgálandó enzimet egy fent meghatározott vegyülettel reagáltatjuk, a reakció során felszabaduló R2-NH2 általános képletű vegyületet, ahol R2 egy fent meghatározott kromofór csoport, fotometriás vagy spektrofotometriás úton önmagában ismert módon meghatározzuk, és a mérési adatokból kiszámítjuk a szerint proteáz mennyiségét. Az eljárás során végbemenő enzimatikus reakciót az alábbi egyenlettel szemléltethetjük: E + S ^ ES -»■ ES + P! kromofór termék E + P2 ahol E az enzimet, S a szubsztrátot, ES az enzim-szubsztrát komplexet, Pi és P2 a termékeket szimbolizálja. A Pi termék képződésének sebességét az alábbi egyenlettel fejezhetjük ki: Vmax • [S] v =-------------- (1) Km + [S] amely a Lineweaver-Burk egyenlet alakjában is megadható: 1 Km í 1- ----------------+------- (2) v Vmax [S] Vmax Amint az (1) egyenletből kitűnik, a Km és Vmax konstansok határozzák meg az enzim szubsztrátjának az illető enzimre való érzékenységét. E konstansokat az alábbiak szerint határozzuk meg: Az enzimet és a szubsztrátot pufferoldatban összekeverjük, és a reakciót mintegy 2 percig követjük spektrofotometriás úton. A szubsztrát [S] koncentrációját változtatjuk, míg az enzim [E] koncentrációját azonos értéken tartjuk. Azextinkciót (OD) az idő függvényében grafikusan ábrázoljuk. Az így kapott görbe tangense (az egy percre eső extinkció-különbség, AOD/perc, amelyből a kromofór termék képződési sebessége számítható pmól/perc dimenzióban) a nulla időpontban megfelel a kezdeti reakciósebességnek, (v). Ha az — értéket az — függvényében ábrázoljuk grafikusan, akkor egy Lineweaver-Burk diagramhoz jutunk. Ebből grafikusan meghatározhatjuk a Km és Vmax konstansokat. A találmányt az alábbi példákban világítjuk meg közelebbről, az oltalmi kör korlátozása nélkül. A példákban különféle szubsztrátoknak a találmány szerinti többlépéses szintézissel való előállítását szemléltetjük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
