174263. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szerin proteázok meghatározására, valamint a meghatározáshoz használható kromogén enzim-szubsztrátok előállítására
5 174263 6 Az eluátumok és termékek vékonyrétegkromatográfiás vizsgálata során adszorbensként üveglapra felvitt F254 típusú, MERCK gyártmányú szilikagélt használunk. A vizsgálathoz futtatószerként az alábbi rendszereket használjuk: Az oldó-Az elegy Oldószerek szerek jele térfogataránya A n-butanol, ecetsav, víz 3:1:1 C n-butanol, etilacetát, víz 7:1:2 D n-heptán, n-butanol, ecet sav 3:2:1 Pi kloroform, metanol 9 :1 A vékonyrétegkromatogramot először 254 nm hullámhosszú ultraibolya fényben tanulmányoztuk, azután a klór-toluidin reakció segítségével előhívtuk. [G. Pataki: Dünnschichtchromatografie in der Aminosäure- und Peptidchemie, Walter de Gruyter et Co., Berlin (1966) 125.] A továbbiakban az aminosav-részeket az alábbiak szerint rövidítjük: A szabad aminosavat vagy pepiidet úgy jelöljük, hogy az amino-csoportnál H-t, a karboxil-csoportnál -CH-t tüntetünk fel. Az amino-csoportot mindig a képlet baloldalán, a karboxil-csoportot mindig a képlet jobboldalán tüntetjük fel. Valamennyi aminosav L-konfigurációjú, hacsak mást nem említünk. Alá = alanin lieu = izoleucin Arg = arginin Leu = leucin Asn = asparagin Met = metionin Asp = Aszparaginsav Phe = fenilalanin Gin = glutamin Pro = prolin Gu = glutaminsav Tyr = tirozin Gy = glicin Val = valin További rövidítések: Ac Ac20 AcOH BOC Bz Bzl Bz20 Cbo DCC1 DMF Et3N MCbo MeOH OtBU OEt OMe acetil-csoport ecetsavanhidrid ecetsav terc-butiloxikarbonil-csoport benzoil-csoport benzil-cső port benzoesavanhidrid karbobenzoxi-csoport diciklohexilkarbodümid dimetilformamid trietilamin p-metoxifenilazo-karbobenzoxi-csoport metanol terc-butiloxi-csoport etoxi-csoport metoxi-cső port Op NP = p-nitrofenoxi-csoport OisoPr = izo-pro piloxi-csoport pNA = p-nitroanilid TFA = trifluoracetil-csoport Tos = p-toluolszulfonil-csoport A hőmérsékletet mindig °C-okban adjuk meg, hacsak kifejezetten mást nem említünk. 10 1. példa Bz-IIeu-Glu-GIy-Arg-pNA • HC1 15 la) Cbo-Gly-Arg-(N02)-pNa (M = 530,4) 5,0 g (10,6 mmól) Cbo-Arg(N02)-pNa-t feloldunk 21 ml ecetsavban és 22 ml ecetsavas 4 n HBr-oldatot adunk hozzá a nedvesség kizárása mellett. A 20 reakcióelegyet egy órán át keverjük szobahőmérsékleten, azután erőteljes keverés közben lassan hozzáadjuk 200 ml éterhez. Az éteres fázist dekantáljuk, a szemcsés maradékot még kétszer mossuk 100 ml éterrel, majd vákuumban, foszforpentoxidon és gra- 25 nulált kálíumhidroxidon 30 °C hőmérsékleten megszárítjuk. Az aminosav-származék hidrobromidját kapjuk közel kvantitatív hozammal, 4,95 g mennyiségben. A termék a vékonyrétegkromatogram szerint (A futtatóeleggyel futtatva) homogén anyagnak 30 bizonyult. Az előbbi terméket 50 ml desztillált DMF-ben oldjuk. Az oldatot —10°C-ra hűtjük le, és trietilaminnal semlegesítjük. Ehhez mintegy 2,1 ml trie- 35 tilamin szükséges. A kicsapódott trietilamin-hidrobromidot kiszűrjük, és a szűrletet -10 °C-ra hűtjük le. Ezután hozzáadunk 3,9 g (11,8 mmól) CBO-Gly-OpNP-t, és az oldat hőmérsékletét szobahőmérsékletig engedjük növekedni. Három óra múlva 40 az oldatot ismét -10 °C-ra hűtjük le, és 0,54 g (5,3 mmól) trietilaminnal pufferoljuk. A pufferolást 2-3 óra múlva megismételjük. A reakcióelegyet egy éjszakán át állni hagyjuk, azután 40 °C-on vákuumban bepároljuk. Sűrűn folyó olajat kapunk 45 maradékként, amelyet 100 ml desztillált vízzel alaposan összekeverünk. A vizet dekantáljuk és az említett mosási műveletet még kétszer megismételjük. A visszamaradó olajat meleg metanolban oldjuk, az így kapott oldat lehűtése során kristályos 50 termék válik ki. 4,2 g (75%) la jelű vegyületet kapunk. A vegyület a vékonyrétegkromatogramon (P, futtatóeleggyel futtatva) homogén anyagnak bizonyul, amelynek Rf értéke 0,16. [a]p4 -36° (c = 0,50, metanol). 55 Ib) t-Boc-Glu(gamma-OBzl)-Gly-Arg(N02)-pNA (M = 715,8) 2,65 g (5,0 mmól) la jelű terméket dekarbo- 60 benzoxilezünk, és 2,50 g (5,5 mól) t-Boc-Glu(gamma-OBzl)-OpNP-hez kapcsoljuk az la) példában leírt módszerrel. A nyers terméket gélkromatográflával tisztítjuk egy SEPHADEX LH-20 adszorbenssel töltött, metanollal telített oszlopon. 3,25 g 65 (91%) Ib) jelű terméket kapunk. A termék a 3
