174258. lajstromszámú szabadalom • Eljárás liposzómák vizes diszperziójának előállítására
7 174258 8 A kapott liposzóma-diszperziót gélkromatográfiás eljárással vizsgáljuk. Az eljáráshoz például Sephadex G—200 vagy Sepharose 2B vagy 4B gélt használtunk, amelyeket a Pharmacia cég (Stockholm, Svédország) hoz forgalomba. A liposzóma-diszperzió 5 ml-es részleteit 0,1— 0,5 ml/perc sebességgel felvisszük 2,5 x 20 cm-es oszlopokra, amelyek üzemi nyomása 200 mmHg. Eluálószerként 0,05 mólos (pH 7,4) foszfátpuffert használunk, amely 0,145 mól/liter ekvimoláris nátriumklorid-káliumklorid keveréket tartalmaz. Az 1—3 ml térfogatú eluált frakcióban spektrográfiás vizsgálattal határozzuk meg a liposzóma-frakciót és a bekapszulázatlan anyagot. (A foszfolipidekre jellemző hullámhossz 410nm.) Valamennyi kromatogramra jellemző egy korai csúcs, amely a liposzóma-frakciónak felel meg, és egy későbbi csúcs, amely a bekapszulázatlan frakcióra jellemző. Az így végzett vizsgálatokkal megállapítottuk, hogy a találmány szerinti eljárással előállított liposzóma-diszperziók a kiindulási anyag 60—80%-át vagy még nagyobb részét tartalmazták bekapszulázva, vagyis a liposzóma-képzés csaknem kvantitatív hozammal jár. A korábban ismert eljárások hasonlóképpen megállapított hozama ezzel szemben legfeljebb 20%. 2. példa Az 1. példa szerinti módon járunk el, kiindulási oldatként azonban penicillinamin (gyártja: Fluka A. G. Buchs, Svájc) Í00 mg/ml töménységű, 0,05 ml térfogatú oldatát használjuk 0,15 mólos, 10 mmól foszfát pufferrel pH 7,2-re pufferolva, amely oldatot vizes konyhasó oldattal készítettünk. Ehhez az oldathoz az ultraliangos kezelés előtt 27 mg lecitint, 2,4 ml dibutilétert és 0,6 ml kloroformot adunk. 3. példa Az 1. példa szerinti módon járunk el, kiindulási oldatként azonban imipramin, kémiai nevén 5-(3-dimetilaminopropil)-10,11 -dihidro-5H-dibenz(6f) azepin (gyártja: CIBA-Geigy, Basel, Svájc), 300 mg/ml koncentrációjú, 0,1 ml térfogatú oldatát használjuk, amelyet 0,15 mólos nátriumklorid oldattal készítettünk. Az ultrahangos kezelésnek alávetett szerves fázist oly módon készítjük el, hogy az előbbi oldathoz 25 mg lecitint, 40 mg koleszterint és 3 ml dibutilétert adunk. 4. példa Az 1. példa szerinti módon járunk el, kiindulási oldatként azonban bétametazon-dinátriumfoszfát (gyártja: Merck and Co., Darmstadt, NSZK), 150 mg/ml töménységű, 0,05 ml térfogatú oldatát használjuk, amelyet 0,15 mólos nátriumklorid oldattal készítettünk. Az ultrahangos kezelésnek alávetett szerves fázist oly módon készítjük el, hogy az előbbi oldathoz 15 mg lecitint, 12 mg foszfatidil-etanolamint és 2,5 ml dibutiléter és 0,5 ml kloroform keverékét adjuk. 5. példa 1 mg aktinomicin D 0,5 ml 0,1 mólos vizes foszfátpufferral (pH 7) készített oldatát kapszulázzuk be az alábbiak szerint. 158 mg lecitint és 0,5 ml aktinomicin-oldatot hozzáadunk 8 ml dibutiléterhez, és az így kapott heterogén keveréket ultrahanggal kezeljük két percig, miközben hőmérsékletét hűtőfürdővel 30 °C alatt tartjuk. Az ultrahang frekvenciája 12 kHz, kimeneti teljesítménye 70%. Átlátszó, homogénnak, tűnő, kékes színben játszó folyadékot kapunk. Ezt a folyadékot egy centrifugacsőben 15 ml desztillált vízre rétegezzük. Ekkor olyan kétfázisú rendszert kapunk, amelynek alsó fázisa víz, felső fázisa pedig a dibutiléter, lecitin és aktinomicin-oldat keverékének ultrahangos kezelésekor kapott emulzió. Ezt a kétfázisú rendszert 30 percig centrifugáljuk percenként 30 000 fordulattal. Ezután a felső fázist (a szerves fázist) leszívjuk, az alsó fázist (a vizes fázist) pedig újból centrifugáljuk 30 percig, percenként 30 000 fordulattal. A kapott tiszta, enyhén kék színű folyadékot leszívjuk, a kis térfogatú üledéket, amely nem diszpergált lipidből (lecitinből) áll, eldobjuk. A tiszta folyadék az aktinomicin vizes oldatát tartalmazó liposzómák vizes szuszpenziója. 6. példa 20 ml diizopropiléterhez hozzáadunk 1,5 g lecitint, 0,4 g foszfatidil-szerint és 0,5 g koleszterint, majd 1,8 g aktinomicin D 3 ml foszfátpufferral (0,1 mól, pH 7) készített oldatát. A rendszert az 5. példa szerinti módon kezeljük ultrahanggal 5 percig. Ezután a kapott emulziót egy centrifugacsőben 80 ml trimetilammónium-citrát pufferra (0,1 mól, pH 7) rétegezzük, és a rendszert az 5. példa szerinti módon centrifugáljuk. 30 perc múlva olyan kétfázisú rendszert kapunk, amelynek alsó fázisa a liposzómákat tartalmazó citrát-pufferes tiszta oldat, felső fázisa pedig a diizopropiléter teljes mennyisége. A fázisok szétválasztása után a liposzóma-szuszpenzió mintájának Sephadexen való kromatografálásával megállapíthatjuk, hogy az aktinomicin D 78%-a a liposzómákba ment át. 7. példa Egy 10 ml-es pyrex edénybe betöltünk 200 ml dibutilétert és 1 ml ciklohexánt, azután betöltjük még inzulin 9 ezrelékes nátriumklorid-oldattal készült 10 mg/ml töménységű oldatának 0,2 nd-ét. Az inzulin-oldat pH-ját sósavval előzetesen 3,0-ra állítjuk be. Ezután 150 mg dipalmitoil-foszfatidil-kolint 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
