174150. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nagytisztaságú aktinomicin D előállítására
3 174150 4 Az általunk izolált törzset 1973 április 8-án MNG 109 szám alatt 1-261 jelzéssel az Országos Közegészségügyi Intézetnél letétbe helyeztük. E törzset a „Schierling, B. E., D. Gottlieb: Methods Manual International Cooperative Project for Description and Deposition of Type Cultures of Streptomycetes (Delaware, Ohio, 1964)” követelményeinek megfelelően az alábbiakban írjuk le: Légmicélium színcsoport: (Ettlinger et al. tip.): cinereus. Szubsztrátmicélium színcsoport: flavus-brunus + ruber. Spóratartók típusa: rectus flexibilis. Spórafelület (elektron optika): sima. A légmicélium- és spóraképzés intenzitása táptalajonként változik. A törzs a következőképpen növekszik az egyes táptalajokon (28 °C-on): Keményítő-agar: gyengén fejlett, lassan szürkülő, pontosan nem tipizálható légmicélium, a szubsztrátmicélium „Yellow, Co, 42”. Élénksárga oldódó pigment. Feltűnően egyenes rectus típusú spóratartók 100%-ban. Gyakori az űn. „álörv”-képzés. Glicerin-aszparagin-agar: gyengén fejlett, nem értékelhető légmicélium. A szubsztrátmicélium „Yellow + red, 0147”, világosbarna oldódó pigment. Rectuc-flexibilis: 100%. Gyakori az álörvös elágazás. Burgonya-agar: fejlett, porszerű, sárgás-szürke légmicélium. Igen fejlett, az agarba lassan benövő, narancssárga szubsztrátmicélium. Élénksárga oldódó pigment. Gauze-féle keményitő-agar: fejlett, vöröses-szürke, porszerű légmicélium. Erőteljesen növekedő, élénksárga, gyűrt szubsztrátmicélium. Élénksárga oldódó pigment. Nutrient-agar: légmicélium nincs. Fejlett, gyúrt vöröses-sárga szubsztrátmicélium. Élénk sárgásbarna oldódó pigment. Jensen-féle kazein-agar: gyenge, fehéres, porszerű légmicélium. Gyenge, színtelen, lepelszerű szubsztrátmicélium. Oldódó pigment nincs. Szacharóz-nitrát-agar: gyenge, fehéres, porszerű, sárgásfehér légmicélium. Felgyűrődő, sárga szubsztrátmicélium. Élénksárga oldódó pigment. Szintetikus-agar: légmicélium nincs. Közepesen fejlett, lepelszerű szubsztrátmicélium. Sárga, oldódó pigment. Glükóz-aszparagin-agar: fejlett, porszerű, sárgás, majd szürke légmicélium. Felgyűrődő, sárga szubsztrátmicélium. Élénksárga oldódó pigment. Tripton-élesztőkivonat-agar: légmicélium nincs. A szubsztrátmicélium igen gyenge, lepelszerű és színtelen. Élénksárga oldódó pigment. Zabpehely agar: fejlett, porszerű, sárgás-szürke légmicélium. Fejlett, az agarba lassan benövő, narancssárga szubsztrátmicélium. Intenzív narancssárga oldódó pigment. Zselatin-tápközeg: légmicélium nincs, gyenge, sárga, pehelyszerű szubsztrátmicélium. Oldódó pigment nincs, erőteljes folyósítás. Chromogenitás vaspepton-agaron: negatív. Nitrát redukció: erősen pozitív. A törzs cukorbontó képességét Pridham és Gottlieb módszere szerint [J. Bact. 56, 107 (1948)] határoztuk meg, és az alábbi eredményeket kaptuk: A következő cukrok biztosítanak jó növekedést: 1-arabinóz, D-fruktóz, D-galaktóz, D-glükóz, inozit, inulin, laktóz, D-mannit, melibióz, raffinóz, ramnóz, szacharóz, trehalóz, D-xilóz. Gyenge növekedést biztosít a D-szorbit és a szalicin. Növekedést nem biztosít a dulcit. A cukorbontásokat 28°-on végeztük. A törzs 20 °C és 30 °C között jól növekszik. A törzs a Streptomyces rendszerben (Hütter, R.: Systematik der Streptomyceten, Basel, 1967), a Streptomyces cinereoruber Corbaz et. al. 1957 fajhoz áll a legközelebb. Ettől azonban a szénforrás értékesítő képesség alapján élesen elkülöníthető. Ezért az 1-261 jelű törzs új Streptomyces fajnak tekintendő. Ezt az új fajt Streptomyces rubrifaciens sp. n.-nek neveztük el. Fentiek alapján a találmány eljárás kísérő komponensektől teljesen mentes nagytisztaságú aktinomicin D előállítására mikrobiológiai úton. Az eljárás abban áll, hogy a Streptomyces rubrifaciens sp. n. sugárgomba törzset (letétbe helyezve 1973. április 8-án MNG 109 számon az Országos Közegészségügyi Intézetben) fehérjét, szénhidrátot és ásványi sókat tartalmazó táptalajon aerob körülmények között 20—40 °C-on, előnyösen 28-30 °C-on legalább 60 órán át, célszerűen 100—120 órán át tenyésztjük, és az így kapott tenyészetből az aktinomicin D-t extrakciós módszerrel elkülönítjük. Minthogy a tenyészetben más aktinomicin-fajta nem fordid elő, az aktinomicin D az erjesztéses oldatból igen egyszerű módon nyerhető ki. A fermentléhez a fermentáció befejezése után 0,5-5,0 súlyszázalék mennyiségű, célszerűen 1—2% mennyiségű olyan adszorbenst, célszerűen fullerföldet adunk, mely az oldatban levő aktinomicin D-t adszorbeálja, majd az elegyet valamely szerves vagy szervetlen savval, célszerűen oxálsawal pH = 3-5, célszerűen 4-es értékre savanyítjuk, ezután az elegyet szűrjük. Ilyen körülmények között a szűrlet aktinomicin D tartalma 20 /ig/ml-nél kevesebb, és így a szűrlet feldolgozására nincs szükség. A kiszűrt szilárd alkotórészeket (micélium és az adszorbens) vízzel jól kimossuk, majd levegőáramban 20—40 °C-on megszárítjuk. A szárított aktinomicin D-t tartalmazó szdárd masszát (nedvesség tartalma maximum 5%) petroléterrel zsírmentesítjük, és ezután valamely vízzel elegyedő szerves oldószerrel, célszerűen acetonnal több lépésben keverés közben extraháljuk. A kapott aktinomicin D tartalmú extraktumokat vákuumban szirupsűrűségre pároljuk be, majd a párlási maradékot petroléterrel mossuk, és az így kapott nyers aktinomicin D-t, mely 65—80% tisztaságú, célszerűen etanolból, etanol-kloroform elegyből vagy esetleg etilacetátból átkristályosítjuk. A kapott kristályos aktinomicin D-t szükség esetén szenes derítéssel kombinálva még egyszer átkristályosítjuk, és így 100%-os tisztaságú aktinomicin D-t kapunk. Az jgy kapott aktinomicin D valamennyi fizikai, kémiai állandója és biológiai tulajdonsága eléri az irodalmi adatokat, sőt termékünk tisztább annál. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
