174150. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nagytisztaságú aktinomicin D előállítására
5 174150 6 Körpapírkromatográfiás módszerrel vizsgálva, teljesen egységesen viselkedik, egyéb aktinomicin komponensek nem mutathatók ki (mennyiségük 0,1% alatt van). Olvadáspontja: 247-249 °C (bomlás közben). Optikai forgatóképessége: (a)o = —360° (1%, etanol) —330° (1%, metanol) —364° (1%, kloroform). Ultraibolya spektruma: max.: 241 nm, a = 26,4 444 nm, a = 20,2 (metanolos oldat). Összegképlete: C62H86Ni2016 Elemi analízise: számított: C = 59,33%, H = 6,86%, N = 13,40%, talált: C = 58,62%, H = 7,22%, N = 13,55%, hamu = 0 Terápiás felhasználás céljára az aktinomicin D-ből injekciós készítményt készíthetünk oly módon, hogy az aktinomicin D-t 20-100-szoros, célszerűen 80-szoros mennyiségű mannit jelenlétében hidegvízben feloldjuk, és az oldatot sterilre szűrjük, majd az oldatból liofilizálássa1 lio-ampullákat készítünk. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg: 1. példa a) Az aktinomicin D fermentálása A Streptomyces rubrifaciens sp. n. törzset (MNG-109) burgonyalé-glükózos agáron tenyésztjük, a keletkező spórákat 3 ml víz segítségével lemossuk, és a kapott spóraszuszpenzió 1 ml-ével 100 ml táptalajt oltunk, melynek összetétele a következő: 3% glükóz 2% szójaliszt 1% kazein -hidrolizát um 0,3% nátrium-klorid 0,5% kalcium-karbonát 0,2% kukoricalekvár pH sterilezés előtt 7,0 100 liter hasznos térfogatú inokulum-készülékben az alábbi összetételű táptalajt készítjük: 3% glükóz 2% szójaliszt 1% kazein-hidrolizátum 0,3% nátrium-klorid 0,5% kalcium-karbonát 0,2% kukoricalekvár pH sterilezés előtt 7,0 Sterilezés után a fent leírt oltóanyaggal beoltjuk az inokulum-készüléket, és percenként 100 liter levegő átbuborékoltatása közben 28 °C-on sterilen növesztjük az organizmust. 45-50 óra múlva, amikor a tenyészet már megfelelően kinőtt, az inokulumot átoltjuk egy 1000 liter hasznos térfogatú fermentorba, amely az alábbi táptalajt tartalmazza: 3% glükóz 2% szójaliszt 1% kazein-hidrolizátum 0,3% nátrium-klorid 0,5% kalcium-karbonát 0,2% kukoricalekvár pH sterilezés előtt 7,0 A fermentációt 28 °C-on 1000 liter levegő percenkénti átáramoltatása és keverés mellett 100-120 órán keresztül folytatjuk, amikor is a fermentlé 700—1000 pg/ml aktivitást ér el. b) Az aktinomicin D elkülönítése 1000 liter erjesztéses oldathoz, melynek aktinomicin D tartalma 860 Mg/ml, 20 kg fullerföldet adunk, majd az elegy pH-ját keverés közben szilárd oxálsawal 4,5-re állítjuk be. Az elegyet megszűrjük, és a csapadékot összesen 250 liter vízzel kimossuk, a 15 pig/ml aktinomicin D-t tartalmazó szűrletet elöntjük, majd a micélium és a fullerföld elegyéből álló csapadékot levegőáramban 35 °C-on 3 napon át szárítjuk. Ily módon 55 kg vörös-barna színű anyaghoz jutunk (nedvesség tartalma maximum 5%), melyet 150 liter ligroinnal elkeverve zsírmentesítünk, majd leszűrjük és szűrőn további 50 liter ligroinnal átmossuk. A kapott csapadékot ezután 3 x 80 liter acetonnal extraháljuk, egyenként 1—1 órán át tartó keveréssel, majd az egyesített acetonos kivonatokat (215 liter, 3300 Mg/ml) vákuumban 40 °C hőmérsékleten szirupsűrűségig bepároljuk. A párlási maradékhoz 10 liter petrolétert adunk, és az anyagot jól eldörzsöljük, majd a szilárd csapadékot leszűrjük, további 5 liter petroléterrel mossuk, majd vákuumban 50 °C-on súlyállandóságig szárítjuk. Ily módon 860 g 76% tisztaságú nyers aktinomicin D-hez jutunk. 100 g fenti módon kapott nyers aktinomicin D-t forralás közben feloldunk 2000 ml 5:1 arányú abszolút etanol-kloroform elegyben, az oldathoz 25 g aktívszenet (Norit A) adunk, majd a meleg oldatot Seitz-lapon leszűrjük, és a szűrlethez 1000 ml abszolút etanolt adunk. Az elegyet 24 órán át 0 °C-on kristályosítjuk. A kivált aktinomicin D kristályokat szüljük, és vákuumban 80 °C-on súlyállandóságig szárítjuk. így összesen 62 g 99% tisztaságú aktinomicin D-t kapunk. Olvadáspont: 245—246 °C. Ezt az aktinomicin D-t hasonló módon átkristályosítva 54 g 100% tisztaságú aktinomicin D-hez jutunk. Olvadáspontja: 247-249°. Szabadalmi igénypont: Eljárás nagytisztaságú aktinomicin D előállítására fermentációs úton, azzal jellemezve, hogy az MNG 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
