174139. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új 1-hidroxi-9-keto-vagy 1,9-dihidroxi-3-alkil-dibenzo [b,dú]piránok előállítására
5 174139 6 lódó hidrogénatomhoz, és kevesebb mennyiségű dsz-konfigurációjú vegyidet keletkezik. A 9-es helyzetű ketoncsoport redukciójával az izomerek olyan keverékét kapjuk, amelyekben a hidroxilcsoport axiális (9a) vagy ekvatoriális (90) konfigurációban van. így egy olyan vegyület, amelyben az oldallánc nem tartalmaz aszimmetrikus centrumokat, például az 1,9-dihidroxi-3-(l ’,1 ’-dimetil-heptil)-6,6-dimetil-6,6a,7,8,10,10a,hexahidro-6H-dibenzo[b,djpirán 4 racemátként vagy racém párokként fordul elő, összesen 8 sztereoizomert alkotva. Egy olyan vegyület, mint például az l,9-dihidroxi-3-(l’,2’-dimetil-heptil)-6,6-dimetil-6,6a,7,8,10,10a-hexahidro-6H- dibenzo[b,d]pirán két további aszimmetrikus centrumot tartalmaz az oldalláncban, így összesen 5 aszimmetrikus centrum található benne, a 6a,9,10a helyzetben és az oldallánc első és második szénatomján, ami azt jelenti, hogy 16 racemátként összesen 32 lehetséges izomer módosulat fordul elő. A 9-es szénatomon ketoncsoportot tartalmazó vegyületek természetesen eggyel kevesebb aszimmetrikus centrummal rendelkeznek. így például az l-hidroxi-3-(l’,l,-dimetil-heptil)-6,6-dimetil-6,6a,7,8, 10,10a-hexahidro-6H-dibenzo[b,d]-pirán - 9-on a 9-hidroxi-analógokkal ellentétben nem 8, hanem 4 sztereoizomer módosulattal rendelkezik. A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek, azaz az alkil-oldallánc utolsó előtti szénatomján hidroxilezett származékok egy további aszimmetrikus szénatommal rendelkeznek. Ez a hidroxilezés valószínűleg sztereoszelektív, azaz a két izomer módosulat közül elsősorban csak az egyik keletkezik. Ha a találmány szerinti eljárással előállított végtermékek oldalláncában ketoncsoport van, további aszimmetrikus szénatom nincs, és a sztereoizomerek száma nem különbözik a kiindulási vegyület sztereoizomer módosulatainak számától. A találmány szerinti eljárással fermentációs úton előállított vegyületekben a 9-es helyzetű keton redukciója révén, ha ezt a csoportot tartalmazó vegyületet adagoljuk szubsztrátként, a 9-es szénatomon egy további aszimmetrikus centrum jöhet létre, ezzel eggyel növekszik az aszimmetrikus szénatomok száma. Ez a redukció valószínűleg szintén sztereospecifikus abban, hogy kizárólag a 9-hidroxi-származék jön létre, nevezetesen a 9S-hidroxi-izomer. A találmány szerinti eljárás értelmében az I általános képletű vegyületek előállítására az alábbiak szerint járunk el: A Bacillus cereus NRRL B—8172 törzs fagyasztva szárított tenyészetével glükózt, ásványi sókat, élesztőkivonatot és más összetevőket tartalmazó vegetatív táptalajt oltunk. A tenyészettel nagyobb térfogatú, a fentivel azonos összetételű táptalajt inokulálunk, a tenyészetet 1-2 napon át tenyésztjük. Az átalakítandó szubsztrátot ekkor adjuk a tenyészethez, de eljárhatunk úgy is, hogy a sejteket összegyűjtjük, és steril pufferban szuszpendálva sejtszuszpenziót készítünk, majd ehhez adagoljuk a szubsztrátot. Az adagolandó vegyületet általában etanolos oldatában adjuk a sejtekhez, a fermentációt 4 és 8 nap közötti időn át végezzük. Az átalakított terméket és a visszamaradó kiindulási anyagot a sejtek kiszűrése előtt vagy után, vízzel nem elegyedő oldószerrel, mint például etilacetáttal kivitelezett extrakcióval különítjük el. A szerves oldószeres extraktumokat egyesítjük, pufferrel mossuk, vízmentesítjük, szűrjük majd csökkentett nyomáson szárazra desztilláljuk. A desztillációs maradékként kapott fermentációs terméket ezt követően oszlopkromatográfiával tisztítjuk. A találmány szerinti eljárás egy másik előnyös kivitelezési változata szerint úgy járunk el, hogy a sejtekben levő oxidációs-redukciós enzim-rendszert a sejtek lízise és a sejttörmelékek kiszűrése után a szűrletben összegyűjtjük. Ezután, az átalakítandó szubsztrátot hozzáadjuk az enzimrendszert megfelelő koncentrációban tartalmazó oldathoz, majd addig rázzuk a reakcióelegyet, míg jelentős mennyiségű I általános képletű vegyület halmozódik fel. A találmány szerinti eljárást a következőkben példákkal részletesen ismertetjük. 1. példa A földmintából izolált Bacillus cereus NRRL B—8172 (A36659) törzset 48—96 órán át, 25° C és 30° C közötti hőmérsékleten a következő összetételű ferde-agaron tenyésztjük: Húskivonat 1,5 g Pepton 6,0 g Élesztőkivonat 3,0 g Agar 20,0 g Ionmentes víz 1,0 liter A táptalajt 15 percen át 121° C hőmérsékleten 2 atm nyomáson autoklávozzuk a használat előtt. A táptalajon kinőtt tenyészeteket 4° C hőmérsékleten tároljuk. A 48—96 órás tenyészeteket fagyasztva szárítjuk, és 4° C hőmérsékleten tároljuk. A fagyasztva szárított sejteket felhasználva a következő összetételű táptalajt oltjuk: Glükóz 30,0 g Élesztőkivonat 1,0 g diammónium-szulfát 10,0 g dinátrium-szulfát 0,5 g dikálium-hidrogén-foszfát 5,0 g magnézium-szulfát heptahidrát 0,4 g vas(Il)-szulfát heptahidrát 0,02 g nangán(II)-szulfát tetrahidrát 0,02 g nátrium-klorid 0,02 g trihidrogén-borát 0,5 mg 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
