174139. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új 1-hidroxi-9-keto-vagy 1,9-dihidroxi-3-alkil-dibenzo [b,dú]piránok előállítására
7 174139 8 *éz(II)-szulfát pentahidrát 0,04 mg dinátrium-molibdenát dihidrát 0,2 mg cink-szulfát heptahidrát 8,0 mg kálcium-klorid 0,05 mg kobalt-klorid sextahidrát 0,2 mg Ionmentes víz 1,0 liter A táptalaj pH-ját 7,0-re állítjuk be tömény, vizes hidrogénldorid oldattal, majd 250 vagy 500 ml térfogatú Erlenmeyer-lombikokban 50 vagy 100 ml térfogatú adagokra osztjuk, a lombikokat gyapotvattával zárjuk. Az autoklávozást az előzőek szerint végezzük. A steril tenyészeteket beoltjuk az NRRL B-8172 törzs fagyasztva szárított tenyészetével, majd 30° C hőmérsékleten 5 cm-es kitéréssel percenként 250-et forduló körkörös rázógépen 24—48 órán át inkubáljuk a tenyészeteket. 2300 percenkénti fordulatszámú centrifugán 20—30 percen át, 4° C hőmérsékleten centrifugáljuk a tenyészlevet, és elkülönítjük a sejteket. Dekantációval eltávolítjuk a felülúszót, a leülepedett sejteket 0,1 mólos, 6—7 pH-jú foszfát-pufferral mossuk. A mosott sejteket kistérfogatú 7,0 pH-ju hasonló, 3% glükózt tartalmazó pufferban reszuszpendáljuk. 500 ml térfogatú steril Erlenmeyer-lombikokba 100—125 ml-t töltünk a kapott szuszpenzióból. Ezt követően mindegyik lombikba 80 mg, 1,5 ml etanolban oldott DL-transz-l-hidroxi-3-(l’,l’-dimetil-heptil)-6,6-dimetil-6,6a,7,8,10,10a-hexahidro-9H-dibenzo[b,d]piránt-9-on-t adunk. Az adagolás után 4—8 napon át folytatjuk az inkubációt. Ezután összeöntjük az inkubált tenyészeteket, és az egyesített szuszpenziót 4-szer, minden alkalommal az eredeti térfogat felének megfelelő térfogatú etilacetáttal extraháljuk. Egyesítjük az etilacetátos extraktumokat, 1/10 térfogatú vízzel mossuk, vízmentesítjük, végül csökkentett nyomáson eltávolítjuk az etilacetátot. A kapott desztillációs maradék tartalmazza az eredeti kiindulási ketont és öt, a fermentáció során keletkezett oxidációs termék keverékét. A desztillációs maradékot nagynyomású folyadékkromatográfiával (Merck szilikagél 60, előcsomagolt oszlop, 0,15 atmoszféra nitrogén-nyomáson kloroformban ekvilibrizálva) tisztítjuk. A desztillációs maradékot kevés kloroformban oldjuk, és az oszlopba töltjük, a kromatográfiát növekvő menynyiségű etilacetátot tartalmazó oldószereleggyel végezzük. A vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat szerint azonos ketont tartalmazó frakciókat egyesítjük. Az ezekben található átalakítási terméket preparatív vékonyrétegkromatográfiával az alábbiak szerint tovább tisztitjuk: az összegyűjtött, egyesített frakciókat csökkentett nyomáson desztilláljuk, a száraz desztillációs maradékot etilacetátban oldjuk. Az etilacetátos oldatokat lemezenként 15—20 mg mintát számítva szilikagél vékonyréteglemezekre cseppentjük. A futtatást benzol és etilacetát 1 :1 arányú elegyével végezzük, amiután levegőn szárítjuk a lemezeket, és az átalakult termékeknek megfelelő területek jelölésére ultraibolya fényben vizsgáljuk. Ezeket a területeket kloroformmal és etilacetáttal eluáljuk, amiután tisztított termékeket kapunk. A következőkben a fentiek szerint kivitelezett előállítási példákat adunk meg. A) Szubsztrát: dl-transz-l-hidroxi-3-(l’,l ’-dimetil-heptil)ó,6-dimetil-6,6a ,7,8,10,10a-hexahidro-9H-dibenzo[b,d]pirán-9-on. Mennyiség: 160 mg Inkubációs idő: 5 nap Elkülönítés: szilikagél kromatográfia Átalakítás: Termék Rf Eluáló oldószer Súly A 0,500 kloroform 5,5 mg C 0,232 kloroform 2% etilacetát-98% kloroform elegye 10,1 mg D 0,179 10% etilacetát és 90% kloroform elegye 17,1 mg Az izolálás során szubsztrátot és dl-transz-1,9- -dihidroxi-3-(l’,l ,-dimetil-heptil)-6,6-dimetil-6,6a,7,8, 10,10a-hexahidro-9H-dibenzo[b,d]pirán (a 9-ketocsoport a-hidroxil csoporttá alakult, 6aR, lOaR, 9R izomer-redukciós termék)-t szintén kaptunk. Az A, C és D vegyületeket sárga színű olajos anyagként kaptuk meg. B. Szubsztrát: mint az A Mennyiség: 320 mg Inkubációs idő: 5 nap Elkülönítés: mint az A Átalakítás: Termékek: A, C és D (lásd A), B, Rf: -0,348, kloroformmal eluálva, a mennyiség 17,5 mg. C, Szubsztrát: mint az A Mennyiség: 800 mg Inkubációs idő: 5 nap Elkülönítés: mint az A Átalakítás: Termékek: A, B, C, D, bizonyos mennyiségű a szubsztrát redukciója révén kapott 1,9-dihidroxi-származékot is kaptunk. A vegyület (±)-transz-3<l ’,1 ’-dimetil-heptil)-6,6a,7,8,10,10a-hexahidro-l-hidroxi-6,6- -dimetil-9H-dibenzo[b,d]pirán-6’,9-dion UV (EtOH) Xmax 208, 230 (váll) és 280 nm (e = 38000, 10000 és 200), 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
