174128. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alkálifém- vagy ammónium-inzulin tisztítására gélszűréssel
7 174128 8 Ha a víz sűrűségét egységesnek tételezzük fel, V, = a • Wr, ahol a száraz gél súlya, Wr pedig a vízfelvétel. Ennek megfelelően Kj a következőképpen fejezhető ki: amelynek értéke a szakértő által kísérleti úton meghatározható. Két oldott anyagot tételezve fel, az eluálási térfogatot mindegyik oldott anyagra a következőképpen fejezzük ki: Az elkülönítési térfogat, V, a két oldott anyag eluálási térfogatainak különbsége: V, = Ve”- Ve’ Vs = (Kd”- KdO V,. A megelőzőkből nyilvánvaló, hogy két (vagy több) oldott anyag elkülönítésének mértéke az oszlopterhelés függvénye. Amint a kisebb molekulasúlyú oldott anyag mennyisége megközelíti a hozzáférhető pórusok határértékét, a két oldott anyag elkülönítésének szükségszerűen csökkennie kell. A különítés és szétválasztás mértéke a találmány részeként meghatározott terhelési határok között változhat. Egyes esetekben nagyobb oszlopterhelést választhatunk annak érdekében, hogy a szételegyedést a termelékenység viszonyát kiegyenlítettük. Amint arra a megelőzőekben rámutattunk, az eluálószer kb. 7,5 és kb. 9,5 közötti pH-jú lehet. Az eluálószer rendesen ugyanannak a bázisnak vagy puffemak a vizes oldata, amelyet az inzulin oldat készítéséhez alkalmaztunk. Az eluálószer kívánt esetben kb. 0,02 mól/liter koncentrációig szervetlen sót, így például nátrium-kloridot, kálium-kloridot, ammónium-kloridot vagy más hasonló sót is tartalmazhat. Az előnyös koncentráció a 0,01 mól, az előnyös só pedig a nátrium-klorid. Az ilyen só használatának előnye, hogy javítja az oldást és meggátolja, hogy a bázisos anyagok abszorbeálódjanak a gélen. Az oszlopról az eluálást kb. 5 °C és kb. 30 °C közötti hőmérsékleten végezhetjük. A művelet előnyös hőmérséklete a szobahőmérséklet vagy ennél alacsonyabb hőmérséklet. Az eluálás műveletét bármely alkalmas módszerrel nyomon követhetjük ugyan, mégis különösen előnyösnek találtuk az egyes frakciók ultraibonya abszorpciójának mérését 280 mpt hullámhosszon. A kívánt tisztított inzulin összetevőt képviselő frakciókat azután egyesítjük és rendszerint cink-inzulinná alakítjuk át. Amint azt már említettük, az inzulin legfontosabb alakja a dnk-inzulin. Ezért a találmány szerinti eljárással előállított nagy tisztaságú alkálifém- vagy ammónium-inzulint cink-inzulinná alakítjuk. Ezt a műveletet előnyösen pH = 6,0-nál, ammóniumacetát puffer jelenlétében hajtjuk végre. A cinkkel történő kristályosításhoz nem szükséges az alkálifém- vagy ammónium-inzulint az cluálószerből elkülöníteni vagy a tisztított inzulin oldatot töményiteni. A találmány szerinti eljárás egyik előnye, hogy az eluálás során kapott inzulin oldat elegendően tömény és így nincs szükség kisózásra vagy izoelektromos kicsapásra, jóllehet, kívánt esetben e műveletek is alkalmazhatók. A találmány szerinti eljárás eredményeként a kapott cink-inzulin nagyobb tisztaságú. Ez a nagyobb tisztaság különböző módszerekkel igazolható. Elemezhetjük közvetlenül a cink-inzulint a nem-inzulin fehérje összetevők, így például a proinzulin és a glukagon jelenlétének megállapítására. A nagy molekulasúlyú fehérjék jelenlétét, amelyek jellemző módon protanúnázt, egy proteolitos, fehérjebontó enzimet is magukban foglalnak, oly módon állapíthatjuk meg, hogy magasabb hőmérsékleteken mérjük a protamin-inzulin szuszpenzió stabilitását: protamináz jelenléte esetén a protamin lebomlás következtében a protamin-inzulin komplex disszociálni fog. Mérhetjük a fizikai tulajdonságokat, így például a cink-inzulin oldhatóságát semleges pH-n és a kapott oldat színét. Végül, biológiai és immunológiai értékmérés útján mérhetjük az inzulin specifikus aktivitását. A találmány szerinti eljárással előállított cink-inzulin, megnövelt tisztasága következtében, kívánatos nyersanyag ahhoz, hogy azt különböző gyógyászati inzulinkészítményekké, így például közönséges inzulinná, isofan-inzulinná, protamin-cink-inzulinná, cink-inzulin szuszpenzióvá, globulin-inzulinná és más hasonló készítményekké dolgozzuk fel. A tisztább dnk-inzulin továbbá lehetővé teszi a savas inzulinnál állandóbb semleges inzulin előállítását is. Olyan szennyeződések, amelyek eddig jelen voltak a cink-inzulinban, semleges pH-nál gyakran részben kicsapódnak. Az ilyen szennyezések között gyakran jelen vannak inzulinbontó enzimek, így a tripszin és a kimotripszin is, amelyek korábban csökkentették az inzulinkészítmény hatóképességét. A tisztább cink-inzulin ugyancsak lehetővé teszi, hogy a múltban szükséges további tisztítás nélkül állíthassuk elő hosszabb hatástartamú sertés és marha inzulinkészítményeket. Végül, isofan-inzulin előállításához a tisztább cink-inzulinból kevesebb protaminra van szükség, minthogy a savas fehérje szennyezések távolléte lehetővé teszi, hogy csak az inzulin kicsapásához szükséges mennyiségű protamint használjuk. A találmány szerinti eljárás kívánt esetben kombinálható más tisztítási módszerekkel. így például az alkálifém- vagy ammónium-inzulin oldatot a gélszűrést megelőzően egy vagy több szűrő műveletnek vethetjük alá, de szűrhetjük egyszer vagy többször az eluált inzulint is, cink-inzulinná történő átalakítása előtt. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
